stringtranslate.com

Анализ одиночных частиц

Анализ отдельных частиц сегментирует и усредняет множество частиц из образца, позволяя компьютерным алгоритмам обрабатывать отдельные изображения в объединенное «репрезентативное» изображение. Это позволяет улучшить соотношение сигнал-шум и может быть объединено с деконволюцией для обеспечения ограниченного улучшения пространственного разрешения изображения.

Анализ одиночных частиц — это группа связанных методов компьютеризированной обработки изображений, используемых для анализа изображений, полученных с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). [1] Эти методы были разработаны для улучшения и расширения информации, получаемой из TEM-изображений образцов частиц, обычно белков или других крупных биологических объектов, таких как вирусы . Отдельные изображения окрашенных или неокрашенных частиц очень зашумлены , и их трудно интерпретировать. Объединение нескольких оцифрованных изображений похожих частиц дает изображение с более четкими и легко интерпретируемыми характеристиками. Расширение этого метода использует методы одной частицы для создания трехмерной реконструкции частицы. С помощью криоэлектронной микроскопии стало возможным генерировать реконструкции с субнанометровым разрешением и разрешением, близким к атомному [2] [3] сначала в случае высокосимметричных вирусов, а теперь и в более мелких асимметричных белках. [4] Анализ одиночных частиц также можно выполнить с помощью масс-спектроскопии с индуцированной связанной плазмой (ICP-MS).

Техники

Анализ одиночных частиц можно проводить как на отрицательно окрашенных , так и на образцах просвечивающей электронной криомикроскопии (CryoTEM) со стекловидным льдом . Методы анализа одиночных частиц, как правило, полагаются на гомогенность образца, хотя методы борьбы с конформационной неоднородностью [5] разрабатываются.

Изображения (микрофотографии) делаются с помощью электронного микроскопа с использованием детекторов с зарядовой связью (ПЗС), соединенных с фосфоресцирующим слоем (ранее вместо этого они собирались на пленку и оцифровывались с помощью высококачественных сканеров). Обработка изображений осуществляется с помощью специализированных программ , часто запускаемых на многопроцессорных компьютерных кластерах . В зависимости от образца или желаемых результатов могут быть выполнены различные этапы двух- или трехмерной обработки.

Кроме того, анализ отдельных частиц также можно выполнять в режиме отдельных частиц с использованием устройства ICP-MS.

Выравнивание и классификация

Биологические образцы, особенно образцы, заключенные в тонкий стекловидный лед , очень чувствительны к радиации, поэтому для визуализации образца можно использовать только низкие дозы электронов. Эта низкая доза, а также различия в используемом металлическом пятне (если оно используется) [6] означают, что изображения имеют высокий уровень шума по сравнению с сигналом, исходящим от наблюдаемой частицы. Совместив несколько похожих изображений друг с другом, чтобы они были в регистре, а затем усреднив их, можно получить изображение с более высоким соотношением сигнал/шум . Поскольку шум в основном распределяется случайным образом, а характеристики основного изображения постоянны, усреднением интенсивности каждого пикселя по нескольким изображениям усиливаются только постоянные характеристики. Обычно оптимальное выравнивание ( перенос и вращение в плоскости) для сопоставления одного изображения с другим рассчитывается посредством взаимной корреляции .

Однако микрофотография часто содержит частицы в нескольких различных ориентациях и/или конформациях, и поэтому для получения более репрезентативных средних значений изображения требуется метод группировки похожих изображений частиц в несколько наборов. Обычно это выполняется с использованием одного из нескольких алгоритмов анализа данных и классификации изображений, таких как многомерный статистический анализ и иерархическая восходящая классификация или кластеризация k -средних . [ нужна цитата ]

Часто используются наборы данных, состоящие из десятков тысяч изображений частиц, и для достижения оптимального решения используется итерационная процедура выравнивания и классификации, при которой сильные усреднения изображений, полученные в результате классификации, используются в качестве эталонных изображений для последующего выравнивания всего набора данных. .

Фильтрация изображений

Фильтрация изображений ( полосовая фильтрация ) часто используется для уменьшения влияния информации о высоких и/или низких пространственных частотах в изображениях, которая может повлиять на результаты процедур выравнивания и классификации. Это особенно полезно при работе с негативными изображениями пятен. В алгоритмах используются быстрые преобразования Фурье ( БПФ ), часто с использованием масок с мягкими краями гауссовой формы в обратном пространстве для подавления определенных частотных диапазонов. Фильтры верхних частот удаляют низкие пространственные частоты (например, эффекты линейного изменения или градиента), оставляя более высокие частоты нетронутыми. Фильтры нижних частот удаляют высокочастотные характеристики и размывают мелкие детали.

Функция передачи контраста

Из-за особенностей формирования изображения в электронном микроскопе светлопольные изображения ПЭМ получаются со значительной недофокусировкой . Это, наряду с особенностями, присущими системе линз микроскопа, создает размытие собранных изображений, видимое как функция рассеяния точки . Комбинированное влияние условий визуализации известно как функция передачи контраста (CTF) и может быть математически аппроксимировано как функция в обратном пространстве. Специализированные методы обработки изображений, такие как переворот фазы и амплитудная коррекция/ фильтрация Винера, могут (по крайней мере частично) [7] корректировать CTF и обеспечивать реконструкцию с высоким разрешением.

Трехмерная реконструкция

Изображения, полученные с помощью просвечивающей электронной микроскопии, представляют собой проекции объекта, показывающие распределение плотности по объекту, аналогично медицинским рентгеновским лучам. Используя теорему о проекции-срезе, можно создать трехмерную реконструкцию объекта путем объединения множества изображений (2D-проекций) объекта, взятых под разными углами обзора. Белки в стекловидном льду в идеале принимают случайное распределение ориентаций (или углов обзора), что позволяет провести достаточно изотропную реконструкцию, если используется большое количество изображений частиц. Это контрастирует с электронной томографией , где углы обзора ограничены из-за геометрии образца/установки изображения, что дает анизотропную реконструкцию. Обратная проекция с фильтром — это широко используемый метод создания трехмерных реконструкций при анализе одиночных частиц, хотя существует множество альтернативных алгоритмов. [3]

Прежде чем можно будет провести реконструкцию, необходимо оценить ориентацию объекта на каждом изображении. Было разработано несколько методов для определения относительных углов Эйлера каждого изображения. Некоторые из них основаны на общих линиях (обычные 1D-проекции и синограммы ), другие используют итерационные алгоритмы сопоставления проекций. Последний работает, начиная с простой исходной трехмерной модели с низким разрешением, сравнивая экспериментальные изображения с проекциями модели и создавая новую трехмерную модель для начальной загрузки решения.

Также доступны методы для создания 3D-реконструкций спиральных образцов (таких как вирус табачной мозаики ), используя присущую им спиральную симметрию . Для этих образцов можно использовать как методы реального пространства (рассматривая участки спирали как отдельные частицы), так и методы обратного пространства (с использованием дифракционных картин).

Методы наклона

Предметный столик микроскопа можно наклонять (обычно вдоль одной оси), что позволяет использовать метод обработки одной частицы, известный как случайный конический наклон. [8] Область образца визуализируется как при нулевом, так и при большом угле наклона (~ 60-70 градусов) или, в случае соответствующего метода реконструкции ортогонального наклона, [9] +45 и -45 градусов. Выбираются пары частиц, соответствующие одному и тому же объекту при двух разных наклонах (пары наклонов), и, следуя параметрам, используемым на последующих этапах выравнивания и классификации, можно относительно легко создать трехмерную реконструкцию. Это связано с тем, что угол обзора (определяемый как три угла Эйлера ) каждой частицы известен из геометрии наклона.

Трехмерные реконструкции на основе случайного конического наклона страдают от отсутствия информации из-за ограниченного диапазона ориентаций. Это явление, известное как «отсутствующий конус» [10] (из-за формы в обратном пространстве), вызывает искажения на 3D-картах. Однако проблему отсутствия конуса часто можно решить, объединив несколько реконструкций наклона. Методы наклона лучше всего подходят для отрицательно окрашенных образцов и могут использоваться для частиц, которые адсорбируются на пленке углеродного носителя в предпочтительной ориентации. Явление, известное как зарядка или движение, вызванное лучом [11], усложняет сбор изображений образцов в стекловидном льду при сильном наклоне.

Визуализация и подгонка карты

Доступны различные программы , позволяющие просматривать 3D-карты. Они часто позволяют пользователю вручную состыковывать координаты белков (структуры из рентгеновской кристаллографии или ЯМР) субъединиц с электронной плотностью. Некоторые программы также могут вычислять субъединицы. [12] [13]

Для структур с более высоким разрешением можно построить макромолекулу напрямую, без предварительных структурных знаний из других методов. Для этой задачи также были разработаны компьютерные алгоритмы. [14]

Поскольку модели Cyro-EM с высоким разрешением являются относительно новыми, инструменты контроля качества не так многочисленны, как для рентгеновских моделей. Тем не менее, cyro-EM («реальное пространство») версии карты разностной плотности , [15] перекрестная проверка с использованием «свободной» карты (сравнимой с использованием свободного R-фактора ), [16] [17] и Стали появляться различные инструменты проверки структуры .

ИСП-МС для одной частицы

Масс-спектроскопия с индуцированной одной частицей связанной плазмой (SP-ICP-MS) используется в нескольких областях, где есть возможность обнаружения и количественного определения взвешенных частиц в пробах жидкостей окружающей среды, оценки их миграции, оценки размера частиц и их распределения. , а также определение их устойчивости в данной среде. SP-ICP-MS был разработан для суспензий частиц в 2000 году Клодом Дегельдром. Он впервые протестировал эту новую методологию в Институте Фореля Женевского университета и представил этот новый аналитический подход на симпозиуме «Коллоид 2oo2» во время собрания EMRS весной 2002 года, а также на заседаниях в 2003 году. [18] В этом исследовании представлены теория СП ИСП-МС и результаты испытаний, проведенных на глинистых частицах (монтмориллоните), а также других суспензиях коллоидов. Затем этот метод был протестирован на наночастицах диоксида тория Degueldre & Favarger (2004), [19] на диоксиде циркония Degueldre et al (2004) [20] и наночастицах золота, которые используются в качестве субстрата в нанофармацевтике, и опубликован Degueldre et al. аль (2006). [21] Впоследствии исследование нано- и микрочастиц диоксида урана послужило поводом для подробной публикации Ref. Дегельдре и др. (2006). [22] С 2010 года интерес к SP ICP-MS резко возрос.

Примеры

Первичная база данных

Рекомендации

  1. ^ Франк, Иоахим (2006). Трехмерная электронная микроскопия макромолекулярных ансамблей: визуализация биологических молекул в нативном состоянии. Оксфорд: Издательство Оксфордского университета. ISBN 978-0-19-518218-7.[ нужна страница ]
  2. ^ Чжоу Чж. (апрель 2008 г.). «На пути к структурному определению атомного разрешения с помощью одночастичной криоэлектронной микроскопии». Современное мнение в области структурной биологии . 18 (2): 218–28. doi :10.1016/j.sbi.2008.03.004. ПМК 2714865 . ПМИД  18403197. 
  3. ^ ab Ван Q, Мацуи Т, Домитрович Т, Чжэн Ю, Дорщук ПК, Джонсон Дж. Э. (март 2013 г.). «Динамика крио-ЭМ-реконструкций, визуализированная с помощью карт дисперсии, полученных с максимальной вероятностью». Журнал структурной биологии . 181 (3): 195–206. дои : 10.1016/j.jsb.2012.11.005. ПМК 3870017 . ПМИД  23246781. 
  4. ^ Бартесаги, Альберто; Мерк, Алан; Банерджи, Суджей; Мэттис, Дорин; Ву, Сюнву; Милн, Жаклин Л.С.; Субраманиам, Шрирам (5 июня 2015 г.). «КриоТЕМ-структура β-галактозидазы с разрешением 2,2 Å в комплексе с ингибитором проникновения в клетку». Наука . 348 (6239): 1147–1151. Бибкод : 2015Sci...348.1147B. doi : 10.1126/science.aab1576. ISSN  1095-9203. ПМК 6512338 . ПМИД  25953817. 
  5. ^ Лайл, Н.; Дас, РК; Паппу, Р.В. (28 сентября 2013 г.). «Количественная мера конформационной гетерогенности белка». Журнал химической физики . 139 (12): 121907. Бибкод : 2013JChPh.139l1907L. дои : 10.1063/1.4812791. ПМК 3724800 . ПМИД  24089719. 
  6. ↑ Пандитаж, Рувин (2 октября 2013 г.). «Краткое введение в контрастирование при подготовке ЭМ-образцов».
  7. ^ Даунинг К.Х., Глейзер Р.М. (август 2008 г.). «Восстановление слабых фазоконтрастных изображений, записанных с высокой степенью расфокусировки: проблема «двойного изображения», связанная с коррекцией CTF». Ультрамикроскопия . 108 (9): 921–8. doi :10.1016/j.ultramic.2008.03.004. ПМЦ 2694513 . ПМИД  18508199. 
  8. ^ Радермахер М., Вагенкнехт Т., Вершур А., Франк Дж. (май 1987 г.). «Трехмерная реконструкция на основе серии случайных конических наклонов за одну экспозицию, примененная к рибосомальной субъединице 50S Escherichia coli». Журнал микроскопии . 146 (Часть 2): 113–36. дои : 10.1111/j.1365-2818.1987.tb01333.x . ПМИД  3302267.
  9. ^ Лешзинер, А (2010). «Метод реконструкции ортогонального наклона». Крио-ЭМ, Часть Б: 3-D реконструкция . Методы энзимологии. Том. 482. стр. 237–62. дои : 10.1016/S0076-6879(10)82010-5. ISBN 9780123849915. ПМИД  20888964.
  10. ^ https://www.c-cina.org/research/algorithms/missing-cone/. {{cite web}}: Отсутствует или пусто |title=( помощь )
  11. ^ Ли, Сюэмин; Муни, Пол; Чжэн, Шон; Бут, Кристофер Р.; Браунфельд, Майкл Б.; Губбенс, Сандер; Агард, Дэвид А.; Ченг, Ифань (июнь 2013 г.). «Подсчет электронов и коррекция движения, индуцированная лучом, обеспечивают одночастичную криоЭМ с разрешением, близким к атомному». Природные методы . 10 (6): 584–590. дои : 10.1038/nmeth.2472. ISSN  1548-7105. ПМЦ 3684049 . ПМИД  23644547. 
  12. ^ «Крио-ЭМ-структурное решение с использованием Phenix» . phenix-online.org .
  13. ^ Николлс, РА; Тыкач, М; Ковалевский О; Муршудов, Г.Н. (1 июня 2018 г.). «Современные подходы к настройке и уточнению атомных моделей в крио-ЭМ-картах с использованием CCP-EM». Акта Кристаллографика. Секция D. Структурная биология . 74 (Часть 6): 492–505. Бибкод : 2018AcCrD..74..492N. дои : 10.1107/S2059798318007313 . ПМК 6096485 . ПМИД  29872001. 
  14. ^ Джамали, Киараш; Келл, Лукас; Чжан, Руй; Браун, Алан; Киманиус, Дари; Scheres, Sjors HW (16 мая 2023 г.), «Автоматизированная модель здания и идентификация белка на картах крио-ЭМ», Biorxiv: Сервер препринта для биологии : 2023.05.16.541002, DOI : 10.1101/2023.05.16.541002, PMC 10245678, PMID 3726816.541002, PMC 10245678, PMID 37268181816.541002, PMC 10245678 , PMID  372681818181818181818181816 . 
  15. ^ Ямасита, Кейтаро; Палмер, Колин М.; Бернли, Том; Муршудов, Гариб Н. (1 октября 2021 г.). «Уточнение одночастичной структуры Cryo-EM и расчет карты с использованием Servalcat». Acta Crystallographica Раздел D Структурная биология . 77 (10): 1282–1291. Бибкод : 2021AcCrD..77.1282Y. дои : 10.1107/S2059798321009475 . ПМЦ 8489229 . ПМИД  34605431. 
  16. ^ Фолкнер, Б; Шредер, Г.Ф. (28 мая 2013 г.). «Перекрестная проверка структурного моделирования на основе криоЭМ». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 110 (22): 8930–5. Бибкод : 2013PNAS..110.8930F. дои : 10.1073/pnas.1119041110 . ПМК 3670386 . ПМИД  23674685. 
  17. ^ Беккерс, Максимилиан; Манн, Дэниел; Саксе, Карстен (март 2021 г.). «Структурная интерпретация реконструкций крио-ЭМ изображений». Прогресс биофизики и молекулярной биологии . 160 : 26–36. doi : 10.1016/j.pbiomolbio.2020.07.004 . ПМИД  32735944.
  18. ^ К. Дегельдре и П. -Ю. Фаваргер, «Коллоидный анализ с помощью масс-спектроскопии с индуктивно связанной плазмой одночастичной: технико-экономическое обоснование», Коллоиды и поверхности A: физико-химические и инженерные аспекты, симпозиум C весенней встречи E-MRS 2002 в Страсбурге, Франция, том. 217, № 1, 28 апреля 2003 г., с. 137–142 (ISSN 0927-7757, DOI 10.1016/S0927-7757(02)00568-X)
  19. ^ C Degueldre et P. -Y Favarger, «Анализ коллоида тория методом одночастичной масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой», Talanta, vol. 62, № 5, 19 апреля 2004 г., с. 1051–1054 (ISSN 0039-9140, DOI 10.1016/j.talanta.2003.10.016).
  20. ^ К. Дегельдре, П. -Ю. Фаваргер и К. Битеа, «Анализ коллоида циркония методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой одной частицы», Analytica Chimica Acta, vol. 518, № 1, 2 августа 2004 г., с. 137–142 (ISSN 0003-2670, DOI 10.1016/j.aca.2004.04.015)
  21. ^ К. Дегельдре, П. -Ю. Фаваргер и С. Уолд, «Анализ коллоида золота методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой в одночастичном режиме», Analytica Chimica Acta, vol. 555, № 2, 12 января 2006 г., с. 263–268 (ISSN 0003-2670, DOI 10.1016/j.aca.2005.09.021)
  22. ^ К. Дегельдре, П. -Ю. Фаваргер, Р. Россе и С. Уолд, «Анализ коллоида урана методом одночастичной масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой», Talanta, vol. 68, № 3, 15 января 2006 г., с. 623–628 (ISSN 0039-9140, DOI 10.1016/j.talanta.2005.05.006).
  23. ^ Ариас-Паломо Э, Рекуеро-Чека М.А., Бустело XR, Льорка О (декабрь 2007 г.). «Трехмерная структура киназы Syk, определенная с помощью одночастичной электронной микроскопии». Биохим. Биофиз. Акта . 1774 (12): 1493–9. дои : 10.1016/j.bbapap.2007.10.008. ПМК 2186377 . ПМИД  18021750. 
  24. ^ Японский банк данных по белкам http://www.pdbj.org/emnavi/emnavi_movie.php?id=5137
  25. ^ Чжан Дж., Бейкер М.Л., Шредер Г.Ф. и др. (январь 2010 г.). «Механизм закрытия складчатой ​​камеры в шаперонине II группы». Природа . 463 (7279): 379–83. Бибкод : 2010Natur.463..379Z. дои : 10.1038/nature08701. ПМЦ 2834796 . ПМИД  20090755. 
  26. ^ Японский банк данных по белкам http://www.pdbj.org/emnavi/emnavi_movie.php?id=1623
  27. ^ Гипсон П., Миллс DJ, Воутс Р., Гринингер М., Вонк Дж., Кюльбрандт В. (май 2010 г.). «Прямое структурное понимание механизма переноса субстрата синтазы жирных кислот дрожжей с помощью электронной криомикроскопии». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 107 (20): 9164–9. Бибкод : 2010PNAS..107.9164G. дои : 10.1073/pnas.0913547107 . ПМК 2889056 . ПМИД  20231485. 
  28. ^ Японский банк данных по белкам http://www.pdbj.org/emnavi/emnavi_movie.php?id=5160
  29. ^ Чжан X, Цзинь Л., Фан Q, Хуэй WH, Чжоу Чжоу (апрель 2010 г.). «3.3 Крио-ЭМ-структура вируса без оболочки обнаруживает механизм прайминга для проникновения в клетку». Клетка . 141 (3): 472–82. дои : 10.1016/j.cell.2010.03.041. ПМЦ 3422562 . ПМИД  20398923. 

Внешние ссылки