Методы анализа белков — это методы, используемые для изучения белков . Существуют экспериментальные методы изучения белков (например, для обнаружения белков, для выделения и очистки белков, а также для характеристики структуры и функции белков, [1] часто требующие, чтобы белок был сначала очищен). Вычислительные методы обычно используют компьютерные программы для анализа белков. Однако многие экспериментальные методы (например, масс-спектрометрия ) требуют вычислительного анализа необработанных данных. [2]
Экспериментальный анализ белков обычно требует экспрессии и очистки белков. Экспрессия достигается путем манипулирования ДНК, которая кодирует интересующий белок(ы). Следовательно, анализ белков обычно требует методов ДНК, особенно клонирования . Некоторые примеры генетических методов включают концептуальную трансляцию, направленный мутагенез , использование белка слияния и сопоставление аллеля с болезненными состояниями. [3] Некоторые белки никогда не были напрямую секвенированы, однако путем трансляции кодонов из известных последовательностей мРНК в аминокислоты методом, известным как концептуальная трансляция. (См. генетический код .) Направленный мутагенез избирательно вводит мутации, которые изменяют структуру белка. [4] Функцию частей белков можно лучше понять, изучая изменение фенотипа в результате этого изменения. Слитые белки производятся путем вставки белковых меток, таких как His-тег , для получения модифицированного белка, который легче отслеживать. Примером этого может служить GFP-Snf2H, который состоит из белка, связанного с зеленым флуоресцентным белком для образования гибридного белка. Путем анализа ДНК аллели могут быть идентифицированы как связанные с болезненными состояниями, например, при расчете показателей LOD . [5]
Извлечение белка из тканей с жесткими внеклеточными матрицами (например, образцы биопсии, венозные ткани, хрящи, кожа) часто достигается в лабораторных условиях путем ударного измельчения в жидком азоте. [6] Образцы замораживаются в жидком азоте и затем подвергаются ударному или механическому измельчению. [7] Поскольку вода в образцах становится очень хрупкой при этих температурах, образцы часто измельчаются до набора мелких фрагментов, которые затем можно растворить для извлечения белка. Для этой цели иногда используются устройства из нержавеющей стали, известные как измельчители тканей. Преимущества этих устройств включают высокий уровень извлечения белка из небольших ценных образцов, недостатки включают низкий уровень перекрестного загрязнения. [8]
Очистка белка является критическим процессом в молекулярной биологии и биохимии, направленным на выделение определенного белка из сложной смеси, такой как клеточные лизаты или тканевые экстракты. [9] Цель состоит в том, чтобы получить белок в чистой форме, который сохраняет свою биологическую активность для дальнейшего изучения, включая функциональные анализы, структурный анализ или терапевтическое применение. Процесс очистки обычно включает несколько этапов, включая лизис клеток, экстракцию белка и комбинацию хроматографических и электрофоретических методов. [10]
Выделение белка относится к извлечению белков из биологических образцов, которые могут включать ткани, клетки или другие материалы. Процесс часто начинается с лизиса клеток, когда клеточные мембраны разрушаются для высвобождения белков в раствор. Это может быть достигнуто с помощью физических методов (например, обработки ультразвуком, гомогенизации) или химических методов (например, детергентов, ферментов). После лизиса смесь обычно очищается центрифугированием для удаления остатков клеток и нерастворимого материала, что позволяет собрать растворимые белки для дальнейшей очистки.
Хроматография — широко используемый метод очистки белков, позволяющий разделять белки на основе различных свойств, включая заряд, размер и связывающую способность. Вот основные типы хроматографии, используемые при очистке белков:
Ионообменная хроматография разделяет белки на основе их чистого заряда при заданном pH. Неподвижная фаза состоит из заряженных смоляных шариков, которые взаимодействуют с противоположно заряженными белками. Когда образец проходит через колонку, белки связываются со смолой, а несвязанные белки вымываются. Постепенно изменяя ионную силу или pH элюирующего буфера, связанные белки могут высвобождаться контролируемым образом, что позволяет проводить эффективное разделение.
Эксклюзионная хроматография разделяет белки на основе их размера. Неподвижная фаза состоит из пористых шариков, которые позволяют более мелким молекулам проникать в поры, в то время как более крупные молекулы проходят мимо них. В результате сначала элюируются более крупные белки, а затем более мелкие. Этот метод особенно полезен для обессоливания или удаления небольших загрязнений из образцов белков.
Аффинная хроматография использует специфические взаимодействия между белками и их лигандами. Целевой белок захватывается на колонке, содержащей лиганд, который специфически связывается с ним, например, антитело, субстрат фермента или ион металла. После вымывания неспецифически связанных белков целевой белок элюируется с использованием раствора, который нарушает взаимодействие белок-лиганд. Этот метод обеспечивает высокую специфичность и часто используется для очистки рекомбинантных белков, имеющих аффинные метки.
Извлечение белков включает в себя выделение белков из сложных биологических образцов с сохранением их функциональности. Часто требуется тщательный выбор буферов для экстракции, содержащих соли, детергенты или стабилизаторы для сохранения структуры и активности белка. Этап солюбилизации имеет решающее значение для белков, связанных с мембраной или нерастворимых в водных растворах. Такие детергенты, как Triton X-100 или SDS, можно использовать для солюбилизации белков из мембран путем разрушения липидных бислоев, что позволяет проводить эффективную экстракцию.
После первоначальной очистки белковые растворы могут нуждаться в концентрации для повышения концентрации белка для последующих применений. Это может быть достигнуто различными методами, включая ультрафильтрацию, которая использует полупроницаемые мембраны для отделения белков от более мелких молекул и солей, и лиофилизацию (сублимационная сушка), которая удаляет воду и позволяет белкам храниться в стабильной форме. Методы осаждения, такие как осаждение сульфатом аммония, также могут использоваться для концентрирования белков путем изменения условий растворимости.
Электрофорез в геле — это мощный аналитический метод, используемый для разделения белков на основе их размера и заряда. Белки загружаются в гелевую матрицу, обычно изготавливаемую из полиакриламида или агарозы, и подается электрический ток. Отрицательно заряженные белки мигрируют к положительному электроду, причем более мелкие белки перемещаются через гелевую матрицу быстрее, чем более крупные. Этот метод имеет решающее значение для оценки чистоты и размера образцов белков.
Денатурирующий гель-электрофорез, обычно выполняемый с использованием SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия), включает обработку белков SDS, детергентом, который денатурирует белки и придает им равномерный отрицательный заряд. Это позволяет разделять белки исключительно на основе их молекулярной массы, предоставляя четкую картину белкового состава образца.
Неденатурирующий гель-электрофорез позволяет белкам сохранять свою нативную структуру при разделении. Этот метод полезен для изучения белок-белковых взаимодействий и активности ферментов. Белки мигрируют через гель в зависимости от их размера и заряда, но их функциональные свойства остаются нетронутыми, что делает его идеальным для анализа комплексов нативных белков.
Двумерный гель-электрофорез сочетает изоэлектрическую фокусировку (IEF) и SDS-PAGE для достижения разделения белков с высоким разрешением. В первом измерении белки разделяются на основе их изоэлектрических точек (pI), а во втором измерении они разделяются по молекулярной массе. Эта техника позволяет анализировать сложные белковые смеси, облегчая идентификацию дифференциально экспрессируемых белков в различных условиях.
Электрофокусировка — это специализированная техника, которая разделяет белки на основе их изоэлектрических точек в градиенте pH. При приложении электрического поля белки мигрируют до тех пор, пока не достигнут точки, где их суммарный заряд равен нулю, эффективно фокусируя их в узкие полосы. Этот метод обеспечивает высокое разрешение и часто используется в сочетании с другими методами для комплексного анализа белков.
Значительно малый размер белковых макромолекул делает идентификацию и количественную оценку неизвестных образцов белка особенно сложными. Было разработано несколько надежных методов количественной оценки белка для упрощения процесса. Эти методы включают метод Варбурга-Кристиана , анализ Лоури и анализ Брэдфорда (все они основаны на поглощательных свойствах макромолекул). Метод анализа Брэдфорда использует краситель для связывания с белком. Чаще всего используется краситель Кумасси бриллиантовый синий G-250. Когда он свободен от белка, краситель красный, но после связывания с белком он становится синим. [11] Комплекс красителя с белком максимально поглощает свет на длине волны 595 нанометров и чувствителен к образцам, содержащим от 1 мкг до 60 мкг. В отличие от методов Лоури и Варбурга-Кристиана, анализ Брэдфорда не основан на содержании триптофана и тирозина в белках, что позволяет методу быть более точным гипотетически. Анализ Лоури похож на анализы биурета, но он использует реагент Фолина, который более точен для количественной оценки. Реагент Фолина стабилен только в кислых условиях, и метод подвержен искажению результатов в зависимости от того, сколько триптофана и тирозина присутствует в исследуемом белке. [12] Реагент Фолина связывается с триптофаном и тирозином, что означает, что концентрация двух аминокислот влияет на чувствительность метода. Метод чувствителен в диапазонах концентраций, аналогичных методу Брэдфорда, но требует незначительно большего количества белка. Метод Варбурга-Кристиана проверяет белки в их естественных диапазонах поглощения. Большинство белков очень хорошо поглощают свет при 280 нанометрах из-за присутствия триптофана и тирозина, но метод подвержен различным количествам аминокислот, на которых он основан.
Ниже перечислены дополнительные методы, которые ссылаются на более подробные описания соответствующих методов.