В молекулярной биологии мутагенез является важным лабораторным методом, с помощью которого мутации ДНК намеренно создаются для создания библиотек мутантных генов, белков, штаммов бактерий или других генетически модифицированных организмов . Различные компоненты гена, а также его регуляторные элементы и его генные продукты могут подвергаться мутациям, что позволяет детально изучить функционирование генетического локуса, процесса или продукта. Мутация может привести к образованию мутантных белков с интересными свойствами или улучшенными или новыми функциями, которые могут найти коммерческое использование. Также можно получить мутантные штаммы, которые имеют практическое применение или позволяют исследовать молекулярную основу конкретной функции клетки.
Сегодня существует множество методов мутагенеза. Первоначально мутации, искусственно вызванные в лаборатории, были совершенно случайными с использованием таких механизмов, как УФ-облучение. Случайный мутагенез не может быть нацелен на определенные области или последовательности генома; однако с развитием сайт-направленного мутагенеза можно внести более специфические изменения. С 2013 года развитие технологии CRISPR /Cas9, основанной на системе защиты прокариот от вирусов, позволило редактировать или мутагенез генома in vivo . [1] Сайт-направленный мутагенез оказался полезным в ситуациях, когда случайный мутагенез неэффективен. Другие методы мутагенеза включают комбинаторный и инсерционный мутагенез. Неслучайный мутагенез можно использовать для клонирования ДНК, [2] исследования воздействия мутагенов, [3] и конструирования белков. [4] Он также имеет медицинские применения, такие как помощь пациентам с ослабленным иммунитетом, исследование и лечение заболеваний, включая ВИЧ и рак, а также лечение таких заболеваний, как бета-талассемия . [5]
Ранние подходы к мутагенезу основывались на методах, вызывающих совершенно случайные мутации. В таких методах клетки или организмы подвергаются воздействию мутагенов, таких как УФ-излучение или мутагенные химические вещества, а затем отбираются мутанты с желаемыми характеристиками. Герман Мюллер обнаружил в 1927 году, что рентгеновские лучи могут вызывать генетические мутации у плодовых мух [ 6] и продолжил использовать созданных им мутантов для своих исследований в области генетики . [7] Для Escherichia coli мутанты могут быть выбраны сначала путем воздействия УФ-излучения, а затем высеяны на агаровую среду. Образовавшиеся колонии затем высевают на чашки : одну в богатую среду , другую в минимальную среду, и затем мутанты, имеющие особые потребности в питании, могут быть идентифицированы по их неспособности расти в минимальной среде. Аналогичные процедуры можно повторить с другими типами клеток и с другими средами для селекции.
Позже был разработан ряд методов генерации случайных мутаций в конкретных белках для выявления мутантов с интересными или улучшенными свойствами. Эти методы могут включать использование допированных нуклеотидов в синтезе олигонуклеотидов или проведение реакции ПЦР в условиях, которые усиливают неправильное включение нуклеотидов (ПЦР, склонная к ошибкам), например, за счет снижения точности репликации или использования аналогов нуклеотидов. [8] Разновидностью этого метода интеграции несмещенных мутаций в ген является мутагенез с насыщением последовательности . [9] Продукты ПЦР, содержащие мутации, затем клонируются в вектор экспрессии , после чего можно охарактеризовать полученные мутантные белки.
В исследованиях на животных алкилирующие агенты , такие как N -этил- N- нитрозомочевина (ENU), использовались для создания мутантных мышей. [10] [11] Этилметансульфонат (ЭМС) также часто используется для создания мутантов животных, растений и вирусов. [12] [13] [14]
В законе Европейского Союза (как директива 2001/18) этот вид мутагенеза может использоваться для производства ГМО , но продукты освобождены от регулирования: нет маркировки, нет оценки. [15]
До разработки методов сайт-направленного мутагенеза все возникающие мутации были случайными, и ученым приходилось использовать отбор по желаемому фенотипу, чтобы найти желаемую мутацию. Методы случайного мутагенеза имеют преимущество с точки зрения количества возможных мутаций; однако, хотя случайный мутагенез может привести к изменению отдельных нуклеотидов, он не обеспечивает особого контроля над тем, какой нуклеотид изменяется. [5] Поэтому многие исследователи стремятся внести избранные изменения в ДНК точным и специфичным для сайта способом. Ранние попытки использования аналогов нуклеотидов и других химических веществ были впервые использованы для создания локализованных точковых мутаций . [16] Такие химические вещества включают аминопурин , который индуцирует переход AT в GC , [17] в то время как нитрозогуанидин , [18] бисульфит , [19] и N 4 -гидроксицитидин могут индуцировать переход GC в AT. [20] [21] Эти методы позволяют встраивать в белок специфические мутации; однако они не являются гибкими в отношении типов создаваемых мутантов и не столь специфичны, как более поздние методы сайт-направленного мутагенеза, и поэтому имеют некоторую степень случайности. Другие технологии, такие как расщепление ДНК в определенных участках хромосомы, добавление новых нуклеотидов и замена пар оснований, теперь позволяют решать, куда могут пойти мутации. [11] [8]
Современные методы сайт-специфической мутации берут начало в методе удлинения праймера, разработанном в 1978 году. Такие методы обычно включают использование предварительно изготовленных мутагенных олигонуклеотидов в реакции удлинения праймера с помощью ДНК-полимеразы . Этот метод позволяет производить точечную мутацию, удаление или вставку небольших участков ДНК в определенных участках. Достижения в методологии сделали такой мутагенез теперь относительно простым и эффективным процессом. [3]
Постоянно разрабатываются новые и более эффективные методы сайт-направленного мутагенеза. Например, метод под названием «Экстракт клонирования с помощью бесшовного лигирования» (или сокращенно SLiCE) позволяет клонировать определенные последовательности ДНК внутри генома, и в геном можно вставить более одного фрагмента ДНК одновременно. [2]
Сайт-направленный мутагенез позволяет исследовать влияние конкретной мутации. Есть множество применений; например, его использовали для определения того, насколько восприимчивы определенные виды к химическим веществам, которые часто используются в лабораториях. В эксперименте использовался сайт-направленный мутагенез для имитации ожидаемых мутаций конкретного химического вещества. Мутация привела к изменению конкретных аминокислот, и были проанализированы эффекты этой мутации. [3]
Сайт-направленный подход может применяться систематически с помощью таких методов, как сканирующий аланин мутагенез, при котором остатки систематически мутируют в аланин , чтобы идентифицировать остатки, важные для структуры или функции белка. [22] Другим комплексным подходом является сайт -насыщенный мутагенез, при котором один кодон или набор кодонов могут быть заменены всеми возможными аминокислотами в определенных положениях. [23] [24]
Комбинаторный мутагенез — это метод сайт-направленной белковой инженерии, при котором можно одновременно создать несколько мутантов белка на основе анализа эффектов аддитивных отдельных мутаций. [25] Это полезный метод для оценки комбинаторного влияния большого количества мутаций на функцию белка. [26] Большое количество мутантов может быть проверено на наличие определенной характеристики с помощью комбинаторного анализа. [25] В этом методе множественные положения или короткие последовательности вдоль цепи ДНК могут быть полностью модифицированы для получения обширной библиотеки мутантных белков. [25] Частоту появления полезных вариантов можно повысить с помощью различных методов создания библиотек мутагенеза. Один из подходов к этому методу заключается в извлечении и замене части последовательности ДНК библиотекой последовательностей, содержащей все возможные комбинации в желаемом сайте мутации. Содержимое вставленного сегмента может включать последовательности, имеющие структурное значение, иммуногенные свойства или ферментативную функцию. Сегмент также может быть вставлен в ген случайным образом, чтобы оценить структурное или функциональное значение конкретной части белка. [25]
Вставка одной или нескольких пар оснований, приводящая к мутациям ДНК, также известна как инсерционный мутагенез . [27] Подобные инженерные мутации могут предоставить важную информацию в исследованиях рака, например, понимание механизмов развития заболевания. Ретровирусы и транспозоны являются основными инструментами инсерционного мутагенеза. Ретровирусы, такие как вирус опухоли молочной железы мышей и вирус мышиного лейкоза, можно использовать для идентификации генов, участвующих в канцерогенезе, и понимания биологических путей развития конкретных видов рака. [28] Транспозоны, хромосомные сегменты, которые могут подвергаться транспозиции, могут быть разработаны и применены для инсерционного мутагенеза в качестве инструмента для открытия генов рака. [28] Эти хромосомные сегменты позволяют применять инсерционный мутагенез практически к любой ткани по выбору, а также обеспечивают более полную и объективную глубину секвенирования ДНК. [28]
Исследователи обнаружили четыре механизма инсерционного мутагенеза, которые можно использовать на людях. первый механизм называется вставкой энхансера. Энхансеры усиливают транскрипцию определенного гена, взаимодействуя с промотором этого гена. Этот конкретный механизм был впервые использован, чтобы помочь пациентам с тяжелым иммунодефицитом, которым нужен костный мозг. Затем пациентам вводили гаммаретровирусы, несущие энхансеры. Второй механизм называется вставкой промотора. Промоторы снабжают наши клетки определенными последовательностями, необходимыми для начала трансляции. Вставка промотора помогла исследователям узнать больше о вирусе ВИЧ. Третий механизм – инактивация генов. Примером инактивации генов является использование инсерционного мутагенеза для вставки ретровируса, который разрушает геном Т-клеток у пациентов с лейкемией, и предоставления им специфического антигена, называемого CAR, позволяющего Т-клеткам нацеливаться на раковые клетки. Последний механизм называется заменой на 3'-конце мРНК. В наших генах время от времени происходят точечные мутации, вызывающие бета-талассемию, которая нарушает функцию эритроцитов. Чтобы решить эту проблему, вводится правильная последовательность генов эритроцитов и производится замена. [5]
Гомологичная рекомбинация может быть использована для создания специфической мутации в организме. Вектор, содержащий последовательность ДНК, аналогичную модифицируемому гену, вводится в клетку и посредством процесса рекомбинации заменяет целевой ген в хромосоме. Этот метод можно использовать для введения мутации или выключения гена, например, при производстве нокаутных мышей . [29]
С 2013 года развитие технологии CRISPR -Cas9 позволило эффективно внедрять различные типы мутаций в геном самых разных организмов. Этот метод не требует места вставки транспозона, не оставляет маркера, а его эффективность и простота сделали его предпочтительным методом редактирования генома . [30] [31]
Поскольку стоимость синтеза ДНК-олигонуклеотидов падает, искусственный синтез полного гена теперь является жизнеспособным методом внесения мутаций в ген. Этот метод позволяет осуществлять обширные мутации в нескольких сайтах, включая полную переработку использования кодонов гена для оптимизации его для конкретного организма. [32]