stringtranslate.com

Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией

ОТ-ПЦР

Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) — это лабораторный метод, сочетающий обратную транскрипцию РНК в ДНК ( в данном контексте называемую комплементарной ДНК или кДНК ) и амплификацию конкретных мишеней ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). [1] В основном он используется для измерения количества определенной РНК. Это достигается путем мониторинга реакции амплификации с использованием флуоресценции, метода, называемого ПЦР в реальном времени или количественной ПЦР (кПЦР). Путаница может возникнуть, поскольку некоторые авторы используют аббревиатуру RT-PCR для обозначения ПЦР в реальном времени. В этой статье RT-PCR будет обозначать ПЦР с обратной транскрипцией. Комбинированная ОТ-ПЦР и кПЦР обычно используются для анализа экспрессии генов и количественного определения вирусной РНК в исследовательских и клинических условиях.

Тесная связь между RT-PCR и qPCR привела к метонимическому использованию термина qPCR для обозначения RT-PCR. Такое использование может сбивать с толку, [2] поскольку ОТ-ПЦР может использоваться без кПЦР, например, для обеспечения молекулярного клонирования , секвенирования или простого обнаружения РНК. И наоборот, кПЦР можно использовать без ОТ-ПЦР, например, для количественного определения количества копий определенного фрагмента ДНК.

Номенклатура

Комбинированная техника ОТ-ПЦР и кПЦР была описана как количественная ОТ-ПЦР [3] или ОТ-ПЦР в реальном времени [4] (иногда даже называемая количественной ОТ-ПЦР в реальном времени [5] ), ее по-разному обозначают как qRT-PCR, [6] RT-qPCR, [7] RRT-PCR, [8] и rRT-PCR. [9] Во избежание путаницы в этой статье будут последовательно использоваться следующие сокращения:

Не все авторы, особенно более ранние, используют это соглашение, и читателю следует быть осторожным при переходе по ссылкам. ОТ-ПЦР использовалась для обозначения как ПЦР в реальном времени (кПЦР), так и ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).

История

С момента своего появления в 1977 году нозерн-блоттинг широко использовался для количественного определения РНК, несмотря на его недостатки: (а) трудоемкий метод, (б) требует большого количества РНК для обнаружения и (в) количественно неточный из-за низкой распространенности Содержание РНК. [10] [11] Однако с тех пор, как Кэри Маллис изобрел ПЦР в 1983 году, ОТ-ПЦР с тех пор вытеснила нозерн-блот в качестве метода выбора для обнаружения и количественного определения РНК. [12]

ОТ-ПЦР стала эталонной технологией для обнаружения и/или сравнения уровней РНК по нескольким причинам: (а) она не требует пост-ПЦР-обработки, (б) широкий диапазон (> 10 7 -кратного) РНК численность можно измерить, и (c) это дает представление как о качественных, так и о количественных данных. [5] Благодаря своей простоте, специфичности и чувствительности ОТ-ПЦР используется в широком диапазоне применений: от таких простых экспериментов, как количественное определение дрожжевых клеток в вине, до более сложных применений в качестве диагностических инструментов для обнаружения инфекционных агентов, таких как птичий грипп. вирус и SARS-CoV-2 . [13] [14] [15]

Принципы

При RT-PCR матрица РНК сначала преобразуется в комплементарную ДНК (кДНК) с помощью обратной транскриптазы (RT). Затем кДНК используется в качестве матрицы для экспоненциальной амплификации с использованием ПЦР. Использование RT-PCR для обнаружения транскрипта РНК произвело революцию в изучении экспрессии генов по следующим важным направлениям:

Одноэтапная RT-PCR против двухэтапной RT-PCR

Одноэтапная и двухэтапная RT-PCR

Количественное определение мРНК с помощью RT-PCR может осуществляться как одноэтапной, так и двухэтапной реакцией. Разница между двумя подходами заключается в количестве пробирок, используемых при выполнении процедуры. Двухэтапная реакция требует, чтобы реакция обратной транскриптазы и ПЦР-амплификация проводились в отдельных пробирках. Недостатком двухэтапного подхода является подверженность загрязнению из-за более частой обработки проб. [19] С другой стороны, вся реакция от синтеза кДНК до амплификации ПЦР происходит в одной пробирке при одноэтапном подходе. Считается, что одноэтапный подход сводит к минимуму экспериментальные вариации, поскольку все ферментативные реакции проводятся в одной среде. Это исключает этапы пипетирования продукта кДНК, который является трудоемким и склонным к загрязнению, для реакции ПЦР. Дальнейшее использование толерантных к ингибиторам полимераз, усилителей полимеразы с оптимизированными условиями одностадийной ОТ-ПЦР, поддерживает обратную транскрипцию РНК из неочищенных или сырых образцов, таких как цельная кровь и сыворотка . [20] [21] Однако исходные матрицы РНК склонны к деградации при одноэтапном подходе, и использование этого подхода не рекомендуется, когда требуются повторные анализы из одного и того же образца. Кроме того, сообщается, что одноэтапный подход менее точен по сравнению с двухэтапным подходом. Это также предпочтительный метод анализа при использовании ДНК-связывающих красителей, таких как SYBR Green, поскольку устранение димеров праймеров может быть достигнуто путем простого изменения температуры плавления . Тем не менее, одноэтапный подход является относительно удобным решением для быстрого обнаружения целевой РНК непосредственно при биосенсорстве. [ нужна цитата ]

Конечная точка ОТ-ПЦР по сравнению с ОТ-ПЦР в реальном времени

Количественную оценку продуктов RT-PCR можно в основном разделить на две категории: конечную точку и в реальном времени. [22] Использование конечной ОТ-ПЦР является предпочтительным для измерения изменений экспрессии генов в небольшом количестве образцов, но ОТ-ПЦР в реальном времени стала золотым стандартным методом для проверки количественных результатов, полученных в результате массивного анализа или экспрессии генов. изменения в глобальном масштабе. [23]

Конечная точка RT-PCR

Подходы к измерению конечной точки ОТ-ПЦР требуют определения уровней экспрессии генов с помощью флуоресцентных красителей, таких как бромид этидия , [24] [25] мечения P32 продуктов ПЦР с использованием фосфоримайзера [ 26] или с помощью сцинтилляционного подсчета . [18] Конечная точка ОТ-ПЦР обычно достигается с использованием трех различных методов: относительного, конкурентного и сравнительного. [27] [28]

Относительная ОТ-ПЦР
Относительная количественная оценка RT-PCR предполагает совместную амплификацию внутреннего контроля одновременно с интересующим геном. Внутренний контроль используется для нормализации образцов. После нормализации можно провести прямое сравнение относительного содержания транскриптов в нескольких образцах мРНК. Следует отметить одну меру предосторожности: внутренний контроль должен быть выбран таким образом, чтобы на него не влияла экспериментальная обработка. Уровень экспрессии должен быть постоянным во всех образцах и с интересующей мРНК, чтобы результаты были точными и значимыми. Поскольку количественная оценка результатов анализируется путем сравнения линейного диапазона целевой и контрольной амплификации, перед началом анализа крайне важно принять во внимание начальную концентрацию целевых молекул и скорость их амплификации. Результаты анализа выражаются как отношения сигнала гена к сигналу внутреннего контроля, значения которого затем можно использовать для сравнения между образцами при оценке относительной экспрессии целевой РНК. [25] [28] [29]
Конкурентная ОТ-ПЦР
Для абсолютного количественного определения используется метод конкурентной RT-PCR. Он предполагает использование синтетической «конкурентной» РНК, которую можно отличить от целевой РНК небольшой разницей в размере или последовательности. Для получения точных результатов важно, чтобы конструкция синтетической РНК была идентична по последовательности, но немного короче целевой РНК. После разработки и синтеза известное количество конкурентной РНК добавляется к экспериментальным образцам и совместно амплифицируется с мишенью с помощью RT-PCR. Затем строится кривая концентрации конкурентной РНК, которая используется для сравнения сигналов RT-PCR, полученных из эндогенных транскриптов, для определения количества мишени, присутствующей в образце. [28] [30]
Сравнительная ОТ-ПЦР
Сравнительная ОТ-ПЦР аналогична конкурентной ОТ-ПЦР в том, что целевая РНК конкурирует за реагенты амплификации в рамках одной реакции с внутренним стандартом несвязанной последовательности. После завершения реакции результаты сравниваются с внешней стандартной кривой для определения целевой концентрации РНК. По сравнению с методами относительного и конкурентного количественного определения сравнительная ОТ-ПЦР считается более удобным методом, поскольку он не требует от исследователя проведения пилотного эксперимента; в относительной RT-PCR необходимо заранее определить диапазон экспоненциальной амплификации мРНК, а в конкурентной RT-PCR необходимо синтезировать синтетическую конкурентную РНК. [28] [31] [32] [33] [34]

ОТ-ПЦР в реальном времени

Появление в последние несколько лет новых методов флуоресцентного мечения ДНК позволило анализировать и обнаруживать продукты ПЦР в режиме реального времени и, как следствие, привело к широкому распространению ОТ-ПЦР в реальном времени для анализа экспрессии генов. [35] ОТ-ПЦР в реальном времени теперь не только метод выбора для количественной оценки экспрессии генов, но и предпочтительный метод получения результатов массивного анализа и экспрессии генов в глобальном масштабе. [36] В настоящее время существует четыре различных флуоресцентных ДНК- зонда для обнаружения продуктов ПЦР в реальном времени с помощью ОТ-ПЦР: SYBR Green , TaqMan , молекулярные маяки и зонды-скорпионы. Все эти зонды позволяют обнаруживать продукты ПЦР путем генерации флуоресцентного сигнала. В то время как краситель SYBR Green излучает свой флуоресцентный сигнал просто путем связывания с двухцепочечной ДНК в растворе, генерация флуоресценции зондов TaqMan, молекулярных маяков и скорпионов зависит от взаимодействия молекулы красителя с резонансной передачей энергии Ферстера (FRET) . тушитель к олигонуклеотидным субстратам. [37]

СИБР Зеленый
Когда SYBR Green связывается с двухцепочечной ДНК продуктов ПЦР, при возбуждении он излучает свет. Интенсивность флуоресценции увеличивается по мере накопления продуктов ПЦР. Этот метод прост в использовании, поскольку нет необходимости в разработке зондов из-за отсутствия специфичности его связывания. Однако, поскольку краситель не отличает двухцепочечную ДНК от продуктов ПЦР и праймеров-димеров, переоценка целевой концентрации является распространенной проблемой. Если точная количественная оценка является абсолютной необходимостью, необходимо провести дальнейший анализ для проверки результатов. Тем не менее, среди методов обнаружения продуктов ОТ-ПЦР в реальном времени SYBR Green является наиболее экономичным и простым в использовании. [22] [23]
Зонды Такмана
Зонды TaqMan
Зонды TaqMan представляют собой олигонуклеотиды, имеющие флуоресцентный зонд, прикрепленный к 5'-концу, и тушитель к 3'-концу. Во время ПЦР-амплификации эти зонды гибридизуются с целевыми последовательностями, расположенными в ампликоне , и, поскольку полимераза реплицирует матрицу со связанным TaqMan, она также расщепляет флуоресцентный зонд из-за активности полимеразы 5'-нуклеазы. Поскольку непосредственная близость между молекулой гашения и флуоресцентным зондом обычно предотвращает обнаружение флуоресценции с помощью FRET, развязка приводит к увеличению интенсивности флуоресценции, пропорциональному количеству циклов расщепления зонда. Хотя хорошо спроектированные зонды TaqMan дают точные результаты ОТ-ПЦР в реальном времени, синтез является дорогостоящим и трудоемким, когда необходимо создавать отдельные зонды для каждой анализируемой мРНК-мишени. [22] [16] [38] Кроме того, эти зонды чувствительны к свету, и их необходимо тщательно замораживать в виде аликвот, чтобы предотвратить разложение.
Молекулярные зонды-маяки
Подобно зондам TaqMan, молекулярные маяки также используют обнаружение FRET с флуоресцентными зондами, прикрепленными к 5'-концу, и тушителем, прикрепленным к 3'-концу олигонуклеотидного субстрата. Однако, хотя флуоресцентные зонды TaqMan расщепляются во время амплификации, зонды-молекулярные маяки остаются интактными и повторно связываются с новой мишенью во время каждого реакционного цикла. В свободном состоянии в растворе непосредственная близость флуоресцентного зонда и молекулы-гасителя предотвращает флуоресценцию через FRET. Однако когда зонды молекулярного маяка гибридизуются с мишенью, флуоресцентный краситель и тушитель разделяются, что приводит к излучению света при возбуждении. Как и в случае с зондами TaqMan, молекулярные маяки дорого синтезировать, и для каждой РНК-мишени требуются отдельные зонды. [19]
Зонды-скорпионы
Зонды-скорпионы, как и молекулярные маяки, не будут флуоресцентно активны в негибридизованном состоянии, опять же, из-за того, что флуоресцентный зонд на 5'-конце гасится фрагментом на 3'-конце олигонуклеотида. Однако у скорпионов 3'-конец также содержит последовательность, которая комплементарна продукту удлинения праймера на 5'-конце. Когда расширение Скорпиона связывается со своим комплементом на ампликоне, структура Скорпиона открывается, предотвращает FRET и позволяет измерить флуоресцентный сигнал. [39]
Мультиплексные зонды
Зонды TaqMan, молекулярные маяки и скорпионы позволяют одновременно измерять продукты ПЦР в одной пробирке. Это возможно, поскольку каждому из различных флуоресцентных красителей может быть присвоен определенный спектр излучения. Использование мультиплексных зондов не только экономит время и усилия без ущерба для полезности тестов, но и их применение в широких областях исследований, таких как анализ делеции генов, анализ мутаций и полиморфизма, количественный анализ и обнаружение РНК, делает его бесценным методом для лабораторий много дисциплины. [39] [40] [41]

Для количественной оценки результатов, полученных с помощью RT-PCR в реальном времени, обычно используются две стратегии; метод стандартной кривой и метод сравнительного порога. [42]

Приложение

Экспоненциальная амплификация с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией обеспечивает высокочувствительный метод, с помощью которого можно обнаружить очень низкое число копий молекул РНК. RT-PCR широко используется в диагностике генетических заболеваний и, в полуколичественном виде, для определения содержания конкретных различных молекул РНК внутри клетки или ткани в качестве меры экспрессии генов .

Методы исследования

RT-PCR обычно используется в исследовательских методах измерения экспрессии генов. Например, Лин и др. использовали qRT-PCR для измерения экспрессии генов Gal в дрожжевых клетках. Во-первых, Лин и др. разработали мутацию белка, предположительно участвующего в регуляции генов Gal. Было высказано предположение, что эта мутация избирательно подавляет экспрессию Gal. Чтобы подтвердить это, уровни экспрессии генов дрожжевых клеток, содержащих эту мутацию, были проанализированы с помощью qRT-PCR. Исследователям удалось окончательно определить, что мутация этого регуляторного белка снижает экспрессию Gal. [43] Нозерн-блот- анализ используется для дальнейшего изучения экспрессии генов РНК.

Вставка гена

ОТ-ПЦР также может быть очень полезна при внедрении эукариотических генов в прокариоты . Поскольку большинство эукариотических генов содержат интроны , которые присутствуют в геноме, но не присутствуют в зрелой мРНК, кДНК, полученная в результате реакции ОТ-ПЦР, представляет собой точную (без учета склонности к ошибкам природы обратных транскриптаз) последовательность ДНК, которая могла бы быть непосредственно транслируется в белок после транскрипции . Когда эти гены экспрессируются в прокариотических клетках с целью производства или очистки белка, РНК, полученная непосредственно в результате транскрипции, не нуждается в сплайсинге, поскольку транскрипт содержит только экзоны . (У прокариот, таких как E. coli, отсутствует механизм сплайсинга мРНК, присущий эукариотам).

Диагностика генетических заболеваний

RT-PCR можно использовать для диагностики генетических заболеваний , таких как синдром Леша-Нихана . Это генетическое заболевание вызвано сбоем в гене HPRT1 , что клинически приводит к фатальному образованию мочекислых мочевых камней и симптомам, сходным с подагрой . [6] [ необходимы разъяснения ] Анализ беременной матери и плода на уровень экспрессии мРНК HPRT1 покажет, является ли мать носителем и есть ли вероятность развития у плода синдрома Леша-Нихана. [44]

Обнаружение рака

Ученые работают над способами использования RT-PCR для выявления рака , чтобы улучшить прогноз и контролировать реакцию на терапию. Циркулирующие опухолевые клетки производят уникальные транскрипты мРНК в зависимости от типа рака. Цель состоит в том, чтобы определить, какие транскрипты мРНК служат лучшими биомаркерами для определенного типа раковых клеток, а затем проанализировать уровни их экспрессии с помощью RT-PCR. [45]

ОТ-ПЦР обычно используется при изучении геномов вирусов , геномы которых состоят из РНК, таких как вирус гриппа А , ретровирусы , такие как ВИЧ и SARS-CoV-2 . [46]

Проблемы

Несмотря на свои основные преимущества, RT-PCR не лишена недостатков. Экспоненциальный рост обратно транскрибируемой комплементарной ДНК (кДНК) во время нескольких циклов ПЦР приводит к неточной количественной оценке конечной точки из-за сложности поддержания линейности. [47] Чтобы обеспечить точное обнаружение и количественную оценку содержания РНК в образце, была разработана qRT-PCR с использованием модификации на основе флуоресценции для мониторинга продуктов амплификации во время каждого цикла ПЦР. Чрезвычайная чувствительность метода может оказаться палкой о двух концах, поскольку даже малейшее загрязнение ДНК может привести к нежелательным результатам. [48] ​​Простой метод устранения ложноположительных результатов заключается во включении якорей или меток в 5'-область ген-специфического праймера. [49] Кроме того, планирование и разработка количественных исследований может быть технически сложной задачей из-за существования многочисленных источников вариаций, включая концентрацию матрицы и эффективность амплификации. [31] В качестве контроля можно использовать добавление известного количества РНК в образец, добавление серии разведений РНК, образующих стандартную кривую, и добавление образца без копии матрицы (без кДНК).

Протокол

RT-PCR можно проводить по одноэтапному протоколу RT-PCR или двухэтапному протоколу RT-PCR.

Одноэтапная RT-PCR

Одноэтапная ОТ-ПЦР подвергает мишени мРНК (до 6 т.п.н.) обратной транскрипции с последующей ПЦР-амплификацией в одной пробирке. Важно отметить, что использование интактной, высококачественной РНК и праймера, специфичного для последовательности, даст наилучшие результаты.

После выбора набора для одноэтапной ОТ-ПЦР со смесью обратной транскриптазы, ДНК-полимеразы Taq и корректирующей полимеразы и получения всех необходимых материалов и оборудования необходимо подготовить реакционную смесь. Реакционная смесь включает dNTP, праймеры, матричную РНК, необходимые ферменты и буферный раствор. Реакционную смесь добавляют в пробирку для ПЦР для каждой реакции, а затем матричную РНК. Затем пробирки для ПЦР помещают в термоциклер, чтобы начать циклический цикл. В первом цикле происходит синтез кДНК. Второй цикл представляет собой начальную денатурацию, при которой инактивируется обратная транскриптаза. Остальные 40–50 циклов — это амплификация, включающая денатурацию, отжиг и элонгацию. После завершения амплификации продукты RT-PCR можно анализировать с помощью гель-электрофореза . [50] [51]

(Руководство по применению ПЦР и биоинструменты)

Двухэтапная ОТ-ПЦР

Двухэтапная RT-PCR, как следует из названия, происходит в два этапа. Сначала обратная транскрипция, а затем ПЦР. Этот метод более чувствителен, чем одноэтапный метод. Наборы также полезны для двухэтапной RT-PCR. Как и в случае одноэтапной ПЦР, для достижения наилучших результатов используйте только неповрежденную высококачественную РНК. Праймер для двухэтапной ПЦР не обязательно должен быть специфичным для последовательности.

Первый шаг

Сначала объедините матричную РНК, праймер, смесь dNTP и воду, не содержащую нуклеазы, в пробирке для ПЦР. Затем добавьте в пробирку для ПЦР ингибитор РНКазы и обратную транскриптазу. Затем поместите пробирку для ПЦР в термоциклер на один цикл, в котором происходит отжиг, удлинение и инактивация обратной транскриптазы. Наконец, переходите непосредственно ко второму этапу — ПЦР или храните продукт на льду до тех пор, пока не будет проведена ПЦР.

Шаг второй

В каждую пробирку для ПЦР добавьте мастер-микс, содержащий буфер, смесь dNTP, MgCl 2 , Taq-полимеразу и воду, не содержащую нуклеазы. Затем добавьте в пробирки необходимый грунт. Затем поместите пробирки ПЦР в термоциклер на 30 циклов программы амплификации. Сюда входят: денатурация, отжиг и элонгация. Продукты RT-PCR можно анализировать с помощью гель-электрофореза. [52]

Рекомендации по публикации

Количественный анализ RT-PCR считается золотым стандартом для измерения количества копий конкретных мишеней кДНК в образце, но он плохо стандартизирован. [53] В результате, хотя существует множество публикаций, использующих этот метод, многие из них предоставляют неадекватные экспериментальные детали и используют неподходящий анализ данных для получения неверных выводов. Из-за присущей вариативности качества любых количественных данных ПЦР рецензентам не только трудно оценить эти рукописи, но и исследования становятся невозможными для повторения. [54] Признавая необходимость стандартизации отчетности об условиях эксперимента, международный консорциум академических ученых опубликовал рекомендации « Минимальная информация для публикации количественных экспериментов с ПЦР в реальном времени» (MIQE, произносится «мики»). Рекомендации MIQE описывают минимальную информацию, необходимую для оценки экспериментов количественной ПЦР , которая должна быть необходима для публикации для поощрения лучшей экспериментальной практики и обеспечения актуальности, точности, правильной интерпретации и повторяемости данных количественной ПЦР. [55]

Помимо правил отчетности, MIQE подчеркивает необходимость стандартизации номенклатуры, связанной с количественной ПЦР, чтобы избежать путаницы; например, аббревиатуру qPCR следует использовать для количественной ПЦР в реальном времени , тогда как RT-qPCR следует использовать для обратной транскрипции-qPCR, а гены, используемые для нормализации, следует называть эталонными генами, а не генами домашнего хозяйства . Он также предлагает не использовать коммерческие термины, такие как зонды TaqMan , а вместо этого называть их гидролизными зондами . Кроме того, предлагается использовать цикл количественного определения (Cq) для описания цикла ПЦР, используемого для количественного определения, вместо порогового цикла (Ct), точки пересечения (Cp) и точки взлета (TOP), которые относятся к одному и тому же значению, но были придуманы разными производителями инструментов реального времени . [53]

Руководство состоит из следующих элементов: 1) дизайн эксперимента, 2) образец, 3) экстракция нуклеиновой кислоты, 4) обратная транскрипция, 5) целевая информация кПЦР, 6) олигонуклеотиды, 7) протокол, 8) проверка и 9) данные анализ. Конкретные элементы внутри каждого элемента имеют пометку E (важно) или D (желательно). Те, что отмечены буквой E, считаются критически важными и незаменимыми, тогда как те, которые отмечены буквой D, считаются второстепенными, но важными для лучших практик. [55]

Рекомендации

  1. ^ Фриман В.М., Уокер С.Дж., Врана К.Е. (январь 1999 г.). «Количественный RT-PCR: подводные камни и потенциал». БиоТехники . 26 (1): 112–22, 124–5. дои : 10.2144/99261rv01 . ПМИД  9894600.
  2. ^ Маккей, Ян (2007). ПЦР в реальном времени в микробиологии: от диагностики к характеристике . Норфолк, Англия: Caister Academic Press. стр. 440. ISBN. 978-1-904455-18-9.
  3. ^ Джойс С. (2002). «Количественный RT-PCR: обзор современных методологий». Протоколы ОТ-ПЦР . Методы Мол. Биол. Том. 193. стр. 83–92. дои : 10.1385/1-59259-283-X:083. ISBN 978-1-59259-283-8. ПМИД  12325527.
  4. ^ Кан XP, Цзян Т, Ли YQ и др. (2010). «Дуплексный анализ RT-PCR в реальном времени для обнаружения вируса птичьего гриппа H5N1 и вируса пандемического гриппа H1N1». Вирол. Дж . 7 : 113. дои : 10.1186/1743-422X-7-113 . ПМЦ 2892456 . ПМИД  20515509. 
  5. ^ аб Бустин С.А., Бенеш В., Нолан Т., Пфаффл М.В. (июнь 2005 г.). «Количественная RT-PCR в реальном времени - перспектива». Дж. Мол. Эндокринол . 34 (3): 597–601. CiteSeerX 10.1.1.528.6638 . дои : 10.1677/jme.1.01755. PMID  15956331. S2CID  1754364. 
  6. ^ Варкони-Гасич Э., Hellens RP (2010). «qRT-PCR малых РНК». Эпигенетика растений . Методы молекулярной биологии. Том. 631. стр. 109–22. дои : 10.1007/978-1-60761-646-7_10. ISBN 978-1-60761-645-0. ПМИД  20204872.
  7. ^ Тейлор С., Уэйкем М., Дейкман Г., Алсаррадж М., Нгуен М. (апрель 2010 г.). «Практический подход к публикации данных RT-qPCR, соответствующих рекомендациям MIQE». Методы . 50 (4): С1–5. дои : 10.1016/j.ymeth.2010.01.005. ПМИД  20215014.
  8. ^ Спакман Э., Сенн Д.А., Майерс Т.Дж. и др. (сентябрь 2002 г.). «Разработка ПЦР-анализа с обратной транскриптазой в реальном времени для вируса гриппа типа А и птичьих подтипов гемагглютинина H5 и H7». Дж. Клин. Микробиол . 40 (9): 3256–60. дои : 10.1128/jcm.40.9.3256-3260.2002. ПМК 130722 . ПМИД  12202562. 
  9. ^ «УСКОРЕННОЕ РАЗРЕШЕНИЕ НА ЧРЕЗВЫЧАЙНОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ (EUA) СВОДНЫЙ ТЕСТ RT-PCR на COVID-19 (ЛАБОРАТОРНАЯ КОРПОРАЦИЯ АМЕРИКИ)» . FDA . Проверено 3 апреля 2020 г. .
  10. ^ Alwine JC, Kemp DJ, Stark GR (декабрь 1977 г.). «Метод обнаружения специфических РНК в агарозных гелях путем переноса на диазобензилоксиметиловую бумагу и гибридизации с ДНК-зондами». Учеб. Натл. акад. наук. США . 74 (12): 5350–4. Бибкод : 1977PNAS...74.5350A. дои : 10.1073/pnas.74.12.5350 . ПМК 431715 . ПМИД  414220. 
  11. ^ Стрейт С., Михальски К.В., Эркан М., Клефф Дж., Фрисс Х. (2009). «Нозерн-блот-анализ для обнаружения и количественного определения РНК в клетках и тканях рака поджелудочной железы». Нат Проток . 4 (1): 37–43. дои : 10.1038/nprot.2008.216. PMID  19131955. S2CID  24980302.
  12. ^ Бустин С.А. (октябрь 2000 г.). «Абсолютное количественное определение мРНК с использованием анализа полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени». Дж. Мол. Эндокринол . 25 (2): 169–93. дои : 10.1677/jme.0.0250169 . ПМИД  11013345.
  13. ^ Йерро Н., Эстев-Сарсосо Б., Гонсалес А., Мас А., Гильямон Х.М. (ноябрь 2006 г.). «Количественная ПЦР в реальном времени (КПЦР) и обратная транскрипция-КПЦР для обнаружения и подсчета общего количества дрожжей в вине». Прил. Окружающая среда. Микробиол . 72 (11): 7148–55. Бибкод : 2006ApEnM..72.7148H. дои : 10.1128/AEM.00388-06. ПМЦ 1636171 . ПМИД  17088381. 
  14. ^ Сломка М.Дж., Павлидис Т., Кауард В.Дж. и др. (июль 2009 г.). «Валидированные методы ПЦР с обратной транскриптазой в реальном времени для диагностики и патотипирования евразийских вирусов птичьего гриппа H7». Грипп и другие респираторные вирусы . 3 (4): 151–64. дои : 10.1111/j.1750-2659.2009.00083.x. ПМЦ 4634683 . ПМИД  19627372. 
  15. ^ Краткое описание миссии: Полевой визит ВОЗ в Ухань, Китай, 20–21 января 2020 г.: https://www.who.int/china/news/detail/22-01-2020-field-visit-wuhan-china-jan-2020
  16. ^ аб Дипак С., Коттапалли К., Раквал Р. и др. (июнь 2007 г.). «ПЦР в реальном времени: революция в обнаружении и анализе экспрессии генов». Курс. Геномика . 8 (4): 234–51. дои : 10.2174/138920207781386960. ПМК 2430684 . ПМИД  18645596. 
  17. ^ аб Бустин С.А. (август 2002 г.). «Количественное определение мРНК с использованием ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени (ОТ-ПЦР): тенденции и проблемы». Дж. Мол. Эндокринол . 29 (1): 23–39. дои : 10.1677/jme.0.0290023 . ПМИД  12200227.
  18. ^ аб Суазе Ф, Нтоду-Томе А, Тран С.И., Ростен В., Форж П. (август 1996 г.). «Количественный RT-PCR: пределы и точность». БиоТехники . 21 (2): 280–5. дои : 10.2144/96212rr01 . ПМИД  8862813.
  19. ^ Аб Вонг М.Л., Медрано Дж.Ф. (июль 2005 г.). «ПЦР в реальном времени для количественного определения мРНК». БиоТехники . 39 (1): 75–85. дои : 10.2144/05391rv01 . ПМИД  16060372.
  20. ^ Ли, Ланг; Он, Цзянь-ань; Ван, Вэй; Ся, Юн; Сун, Ли; Чен, Зе-хан; Цзо, Хан-чжи; Тан, Сюань-Пин; Хо, Аарон Хо-Пуи; Конг, Сиу-Кай; Лу, Джеки Фонг-Чуэн (01 августа 2019 г.). «Разработка метода прямой количественной ПЦР с обратной транскрипцией (dirRT-qPCR) для клинической диагностики вируса Зика». Международный журнал инфекционных заболеваний . 85 : 167–174. дои : 10.1016/j.ijid.2019.06.007 . ISSN  1201-9712. ПМИД  31202908.
  21. ^ Бахофен, Клаудия; Уиллоби, Ким; Садокс, Рут; Берр, Пол; Меллор, Доминик; Рассел, Джордж К. (01 июня 2013 г.). «Прямая ОТ-ПЦР из сыворотки позволяет быстро и экономично провести филогенетический анализ вируса вирусной диареи крупного рогатого скота». Журнал вирусологических методов . 190 (1): 1–3. doi :10.1016/j.jviromet.2013.03.015. ISSN  0166-0934. ПМИД  23541784.
  22. ^ abc Шмиттген Т.Д., Закрайсек Б.А., Миллс АГ, Горн В., Сингер М.Дж., Рид М.В. (октябрь 2000 г.). «Количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией для изучения распада мРНК: сравнение методов конечной точки и методов в реальном времени». Анальный. Биохим . 285 (2): 194–204. дои : 10.1006/abio.2000.4753. PMID  11017702. S2CID  258810.
  23. ^ Аб Радживан М.С., Вернон С.Д., Тайсаванг Н., Унгер Э.Р. (февраль 2001 г.). «Проверка профилей экспрессии генов на основе массивов с помощью (кинетической) RT-PCR в реальном времени». Дж Мол Диагн . 3 (1): 26–31. дои : 10.1016/S1525-1578(10)60646-0. ЧВК 1907344 . ПМИД  11227069. 
  24. ^ Стоун-Маршат М, Карвилл А, Сковронек А, Лагрейд В.В. (март 1994 г.). «Обнаружение вируса африканской чумы лошадей методом ПЦР с обратной транскрипцией». Дж. Клин. Микробиол . 32 (3): 697–700. doi :10.1128/JCM.32.3.697-700.1994. ПМК 263109 . ПМИД  8195381. 
  25. ^ ab Minton AP (апрель 1995 г.). «Удержание как фактор, определяющий макромолекулярную структуру и реакционную способность. II. Эффекты слабо притягивающих взаимодействий между ограниченными макрорастворами и удерживающими структурами». Биофиз. Дж . 68 (4): 1311–22. Бибкод : 1995BpJ....68.1311M. дои : 10.1016/S0006-3495(95)80304-8. ПМК 1282026 . ПМИД  7787020. 
  26. ^ Сюй М., Ю Э.Ю., Спрушанский О., Макихерн М.Дж., Лю Н.Ф. (июль 2012 г.). «Функциональный анализ единственного гомолога Est1/Ebs1 в Kluyveromyces Lactis выявляет роль как в поддержании теломер, так и в устойчивости к рапамицину». Эукариотическая клетка . 11 (7): 932–42. дои : 10.1128/EC.05319-11. ПМК 3416500 . ПМИД  22544908. 
  27. ^ Шмиттген Т.Д., Ливак К.Дж. (2008). «Анализ данных ПЦР в реальном времени сравнительным методом C (T)». Нат Проток . 3 (6): 1101–8. дои : 10.1038/nprot.2008.73. PMID  18546601. S2CID  205464270.
  28. ^ abcd Тан, И-Вэй (13 сентября 2012 г.), Передовые методы диагностической микробиологии , Springer, ISBN 978-1461439691
  29. ^ Гаузе WC, Адамович Дж (июнь 1994 г.). «Использование ПЦР для количественной оценки экспрессии генов». Геномные исследования . 3 (6): С123–35. дои : 10.1101/gr.3.6.s123 . ПМИД  7522722.
  30. ^ Цай С.Дж., Wiltbank MC (ноябрь 1996 г.). «Количественное определение мРНК с использованием конкурентной RT-PCR с методологией стандартных кривых». БиоТехники . 21 (5): 862–6. дои : 10.2144/96215st04 . ПМИД  8922627.
  31. ^ ab Ramakers C, Ruijter JM, Deprez RH, Moorman AF (март 2003 г.). «Без допущений анализ количественных данных полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени». Неврология. Летт . 339 (1): 62–6. дои : 10.1016/S0304-3940(02)01423-4. PMID  12618301. S2CID  9459695.
  32. ^ Хэлфорд WP, Falco VC, Гебхардт BM, Карр DJ (январь 1999 г.). «Врожденная количественная емкость полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией». Анальный. Биохим . 266 (2): 181–91. дои : 10.1006/abio.1998.2913 . ПМИД  9888974.
  33. ^ Король Н (2010). «Использование сравнительной количественной RT-PCR для исследования влияния инкубации цистеина на экспрессию GPx1 в свежевыделенных кардиомиоцитах». Протоколы ОТ-ПЦР . Методы молекулярной биологии. Том. 630. стр. 215–32. дои : 10.1007/978-1-60761-629-0_14. ISBN 978-1-60761-628-3. ПМИД  20301000.
  34. ^ Чанг Дж.Т., Чен И.Х., Ляо К.Т. и др. (ноябрь 2002 г.). «Метод сравнительной ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией для количественного обнаружения ангиогенных факторов роста у пациентов с раком головы и шеи». Клин. Биохим . 35 (8): 591–6. дои : 10.1016/S0009-9120(02)00403-4. ПМИД  12498992.
  35. ^ Лу, Роу-Цзянь; Чжао, Ли; Хуан, Бао-Ин; Да, Фэй; Ван, Вэнь-Лин; Тан, Вэнь-Цзе (5 сентября 2021 г.). «Панель анализа полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в режиме реального времени для выявления коронавируса 2 тяжелого острого респираторного синдрома и его вариантов». Китайский медицинский журнал . 134 (17): 2048–2053. дои : 10.1097/CM9.0000000000001687. ПМЦ 8439998 . ПМИД  34402479 . Проверено 17 февраля 2023 г. 
  36. ↑ Джаверт, Николь (27 марта 2020 г.). «Как вирус COVID-19 обнаруживается с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени?». Международное агентство по атомной энергии . Проверено 16 февраля 2023 г.
  37. ^ Холден, MJ; Ван, Л. (2008). «Количественная ПЦР в реальном времени: варианты и проблемы флуоресцентных зондов». Стандартизация и обеспечение качества измерений флуоресценции II . Серия Спрингера по флуоресценции. Том. 6. с. 489. дои : 10.1007/4243_2008_046. ISBN 978-3-540-70570-3.
  38. ^ Ян Д.К., Квеон Ч., Ким Б.Х. и др. (декабрь 2004 г.). «Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией TaqMan для обнаружения вируса японского энцефалита». Дж. Вет. Наука . 5 (4): 345–51. дои : 10.4142/jvs.2004.5.4.345 . ПМИД  15613819.
  39. ^ аб Шарки Ф.Х., Банат ИМ, Марчант Р. (июль 2004 г.). «Обнаружение и количественная оценка экспрессии генов в экологической бактериологии». Прил. Окружающая среда. Микробиол . 70 (7): 3795–806. Бибкод : 2004ApEnM..70.3795S. doi :10.1128/AEM.70.7.3795-3806.2004. ПМЦ 444812 . ПМИД  15240248. 
  40. ^ Рэтклифф Р.М., Чанг Г., Кок Т., Слоотс Т.П. (июль 2007 г.). «Молекулярная диагностика медицинских вирусов». Curr Issues Мол Биол . 9 (2): 87–102. ПМИД  17489437.
  41. ^ Эльнифро Э.М., Ашши А.М., Купер Р.Дж., Клэппер П.Е. (октябрь 2000 г.). «Мультиплексная ПЦР: оптимизация и применение в диагностической вирусологии». Клин. Микробиол. Преподобный . 13 (4): 559–70. doi :10.1128/cmr.13.4.559-570.2000. ПМЦ 88949 . ПМИД  11023957. 
  42. ^ Бустин С.А. (июль 2005 г.). «Количественная ПЦР на основе флуоресценции в реальном времени: обзор текущих процедур и предпочтений». Эксперт преподобный мол. Диагностика . 5 (4): 493–8. дои : 10.1586/14737159.5.4.493. PMID  16013967. S2CID  1833811.
  43. ^ Лин Л., Чемберлен Л., Чжу Л.Дж., Грин М.Р. (февраль 2012 г.). «Анализ активации транскрипции, направленной на Gal4, с использованием мутантов Tra1, избирательно дефектных по взаимодействию с Gal4». Учеб. Натл. акад. наук. США . 109 (6): 1997–2002. Бибкод : 2012PNAS..109.1997L. дои : 10.1073/pnas.1116340109 . ПМЦ 3277556 . ПМИД  22308403. 
  44. ^ Торрес Р.Дж., Гарсия М.Г., Пуиг Дж.Г. (декабрь 2012 г.). «Носительская и пренатальная диагностика болезни Леша-Нихана из-за дефекта регуляции экспрессии генов HPRT». Джин . 511 (2): 306–7. дои : 10.1016/j.gene.2012.09.121. ПМИД  23046577.
  45. ^ Си Л, Никастри Д.Г., Эль-Хефнави Т., Хьюз С.Дж., Лукетич Дж.Д., Годфри Т.Е. (июль 2007 г.). «Оптимальные маркеры для количественного обнаружения с помощью ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени циркулирующих опухолевых клеток меланомы, рака молочной железы, толстой кишки, пищевода, головы и шеи и легких». Клин. Хим . 53 (7): 1206–15. дои : 10.1373/clinchem.2006.081828 . ПМИД  17525108.
  46. ^ «Коронавирус: тест il viaggio dei» . Istituto Superiore di Sanità .
  47. ^ Шиао Ю.Х. (декабрь 2003 г.). «Новый метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией для точного количественного определения». БМК Биотехнология . 3:22 . дои : 10.1186/1472-6750-3-22 . ПМК 317330 . ПМИД  14664723. 
  48. ^ Gettemy JM, Ма Б., Алик М., Голд М.Х. (февраль 1998 г.). «Обратная транскрипция-ПЦР-анализ регуляции семейства генов марганцевой пероксидазы». Прил. Окружающая среда. Микробиол . 64 (2): 569–74. Бибкод : 1998ApEnM..64..569G. doi :10.1128/AEM.64.2.569-574.1998. ПМК 106084 . ПМИД  9464395. 
  49. ^ Мартель, Фатима; Дирк Грундеманн; Эдгар Шойг (31 марта 2002 г.). «Простой метод исключения ложноположительных результатов ОТ-ПЦР». J Biochem Мол Биол . 35 (2): 248–250. дои : 10.5483/BMBRep.2002.35.2.248 . ПМИД  12297038.
  50. ^ «Одностепенный набор инструментов для высокой транскрипции» . Биоинструменты. Архивировано из оригинала 20 мая 2013 года . Проверено 12 декабря 2012 г.
  51. ^ Деген, Ханс-Иоахим; Дойфель, Аннетт; Эйзель, Дорис; Грюневальд-Яно, Стефани; Кизи, Джо (2006). Руководство по применению ПЦР (PDF) (3-е изд.). Рош Диагностика. стр. 135–137.
  52. ^ «Двухэтапный протокол RT-PCR» (PDF) . Массачусетский технологический институт . Проверено 12 декабря 2012 г.
  53. ^ ab "www.microarrays.ca" (PDF) .
  54. ^ Бустин С.А. (апрель 2010 г.). «Почему необходимы рекомендации по публикации qPCR? - Доводы в пользу MIQE». Методы . 50 (4): 217–26. дои : 10.1016/j.ymeth.2009.12.006. ПМИД  20025972.
  55. ^ аб Бустин С.А., Бенеш В., Гарсон Дж.А. и др. (апрель 2009 г.). «Руководство MIQE: минимум информации для публикации количественных экспериментов ПЦР в реальном времени». Клин. Хим . 55 (4): 611–22. дои : 10.1373/clinchem.2008.112797 . ПМИД  19246619.

Внешние ссылки