stringtranslate.com

РНК-полимераза Т7

РНК-полимераза Т7 — это РНК-полимераза из бактериофага Т7 , которая катализирует образование РНК из ДНК в направлении 5'→ 3'. [1]

Активность

Полимераза T7 чрезвычайно специфична к промотору и транскрибирует только ДНК ниже промотора T7. [2] Полимеразе T7 также требуется двухцепочечная ДНК-матрица и ион Mg2 + в качестве кофактора для синтеза РНК. Она имеет очень низкий уровень ошибок. Полимераза T7 имеет молекулярную массу 99 кДа.

Промоутер

Промотор распознается для связывания и инициации транскрипции. Консенсус в T7 и родственных фагах: [2]

5' * 3'T7 TAATACGACTCACTATAGGGAGAT3 AATTAACCCTCACTAAAGGGAGAK11 AATTAGGGCACACTATAGGGAGASP6 ATTTACGACACACTATAGAAGAA связывать------------ -----------инициализация

Транскрипция начинается с гуанина, отмеченного звездочкой. [2]

Структура

Полимераза Т7 была кристаллизована в нескольких формах, а структуры помещены в PDB . Они объясняют, как полимераза Т7 связывается с ДНК и транскрибирует ее. N-концевой домен перемещается по мере формирования комплекса удлинения. ssRNAP содержит гибрид ДНК-РНК из 8 п.н. [3] Петля специфичности бета-шпильки (остатки 739-770 в Т7) распознает промотор; замена его на тот, что находится в РНК-полимеразе Т3, заставляет полимеразу распознавать промоторы Т3. [2]

Подобно другим вирусным полимеразам нуклеиновых кислот , включая ДНК-полимеразу T7 из того же фага, консервативный C-конец T7 ssRNAP использует складку, организация которой была уподоблена форме правой руки с тремя субдоменами, называемыми пальцами, ладонью и большим пальцем. [4] N-конец менее консервативен. Он образует домен связывания промотора (PBD) со спиральными пучками в фаговых ssRNAP, [5] особенность, не обнаруженная в митохондриальных ssRNAP. [6]

Связанные белки

Полимераза T7 является представительным членом семейства односубъединичных ДНК-зависимых РНК-полимераз (ssRNAP). Другие члены включают фаговые T3 и SP6 РНК-полимеразы, митохондриальную РНК-полимеразу ( POLRMT ) и хлоропластную односубъединичную РНК-полимеразу. [7] [8] Семейство односубъединичных РНК-полимераз структурно и эволюционно отличается от многосубъединичного семейства РНК-полимераз (включая бактериальные и эукариотические подсемейства). В отличие от бактериальных РНК-полимераз, полимераза T7 не ингибируется антибиотиком рифампицином . Это семейство связано с односубъединичной обратной транскриптазой и ДНК-полимеразой . [9]

Приложение

В биотехнологических приложениях РНК-полимераза T7 обычно используется для транскрипции ДНК, которая была клонирована в векторы , которые имеют два (различных) промотора фагов (например, T7 и T3 или T7 и SP6) в противоположной ориентации. РНК может быть селективно синтезирована из любой цепи вставки ДНК с помощью различных полимераз. Фермент стимулируется спермидином , а активность in vitro увеличивается за счет присутствия белков-носителей (таких как BSA ). [10] [11]

С помощью этой системы можно получить гомогенно маркированную одноцепочечную РНК. Транскрипты можно нерадиоактивно маркировать до высокой удельной активности с помощью определенных маркированных нуклеотидов.

РНК-полимераза Т7 используется в синтезе мРНК и sgRNA. [12]

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ "T7 РНК-полимераза (20 U/мкл)". www.thermofisher.com . Получено 2023-01-19 .
  2. ^ abcd Rong M, He B, McAllister WT, Durbin RK (январь 1998 г.). "Детерминанты специфичности промотора РНК-полимеразы T7". Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 95 (2): 515–9. Bibcode :1998PNAS...95..515R. doi : 10.1073/pnas.95.2.515 . PMC 1845 . PMID  9435223. 
  3. ^ Tahirov TH, Temiakov D, Anikin M, Patlan V, McAllister WT, Vassilyev DG, Yokoyama S (ноябрь 2002 г.). «Структура комплекса удлинения РНК-полимеразы T7 при разрешении 2,9 A». Nature . 420 (6911): 43–50. Bibcode :2002Natur.420...43T. doi :10.1038/nature01129. PMID  12422209. S2CID  4313486.
  4. ^ Hansen JL, Long AM, Schultz SC (август 1997). «Структура РНК-зависимой РНК-полимеразы полиовируса». Structure . 5 (8): 1109–22. doi : 10.1016/S0969-2126(97)00261-X . PMID  9309225.
  5. ^ Durniak KJ, Bailey S, Steitz TA (октябрь 2008 г.). «Структура транскрибирующей РНК-полимеразы T7 при переходе от инициации к удлинению». Science . 322 (5901): 553–7. Bibcode :2008Sci...322..553D. doi :10.1126/science.1163433. PMC 2892258 . PMID  18948533. 
  6. ^ Hillen HS, Morozov YI, Sarfallah A, Temiakov D, Cramer P (ноябрь 2017 г.). «Структурная основа инициации митохондриальной транскрипции». Cell . 171 (5): 1072–1081.e10. doi :10.1016/j.cell.2017.10.036. PMC 6590061 . PMID  29149603. 
  7. ^ McAllister WT, Raskin CA (октябрь 1993 г.). «Фаговые РНК-полимеразы связаны с ДНК-полимеразами и обратными транскриптазами». Молекулярная микробиология . 10 (1): 1–6. doi :10.1111/j.1365-2958.1993.tb00897.x. PMID  7526118. S2CID  19322112.
  8. ^ Хедтке Б, Бёрнер Т, Вейхе А (август 1997 г.). «РНК-полимеразы митохондриального и хлоропластного фагового типа у арабидопсиса». Наука . 277 (5327): 809–11. дои : 10.1126/science.277.5327.809. ПМИД  9242608.
  9. ^ Чермакян Н., Икеда Т.М., Мирамонтес П., Ланг Б.Ф., Грей М.В., Седергрен Р. (декабрь 1997 г.). «Об эволюции односубъединичных РНК-полимераз». Журнал молекулярной эволюции . 45 (6): 671–81. Бибкод : 1997JMolE..45..671C. CiteSeerX 10.1.1.520.3555 . дои : 10.1007/PL00006271. PMID  9419244. S2CID  1624391. 
  10. ^ Chamberlin M, Ring J (март 1973). «Характеристика полимеразы рибонуклеиновой кислоты, специфичной к Т7. 1. Общие свойства ферментативной реакции и специфичность шаблона фермента». Журнал биологической химии . 248 (6): 2235–44. doi : 10.1016/S0021-9258(19)44211-7 . PMID  4570474.
  11. ^ Maslak M, Martin CT (июнь 1994). «Влияние условий раствора на стационарную кинетику инициации транскрипции РНК-полимеразой T7». Биохимия . 33 (22): 6918–24. doi :10.1021/bi00188a022. PMID  7911327.
  12. ^ "T7 РНК-полимераза | NEB". www.neb.com . Получено 2023-01-19 .

Дальнейшее чтение

Внешние ссылки