Рентгеновский микроскоп использует электромагнитное излучение рентгеновского диапазона для получения увеличенных изображений объектов. Поскольку рентгеновские лучи проникают в большинство объектов, нет необходимости специально готовить их к рентгеновским микроскопическим наблюдениям.
В отличие от видимого света , рентгеновские лучи плохо отражаются и преломляются и невидимы для человеческого глаза. Поэтому рентгеновский микроскоп экспонирует пленку или использует детектор с зарядовой связью (CCD) для обнаружения рентгеновских лучей, проходящих через образец. Это технология контрастной визуализации, использующая разницу в поглощении мягких рентгеновских лучей в области водного окна (длины волн: 2,34–4,4 нм, энергии: 280–530 эВ) атомом углерода (основной элемент, составляющий живую клетку) и атом кислорода (элемент воды).
Микрофокусный рентген также обеспечивает большое увеличение за счет проекции. Микрофокусная рентгеновская трубка излучает рентгеновские лучи из чрезвычайно маленького фокусного пятна (от 5 мкм до 0,1 мкм). Рентгеновские лучи находятся в более традиционном рентгеновском диапазоне (от 20 до 300 кэВ) и не перефокусируются.
История рентгеновской микроскопии восходит к началу 20 века. После того, как немецкий физик Рентген открыл рентгеновские лучи в 1895 году, ученые вскоре осветили объект с помощью точечного источника рентгеновского излучения и получили теневые изображения объекта с разрешением в несколько микрометров. [2] В 1918 году Эйнштейн отметил, что показатель преломления рентгеновских лучей в большинстве сред должен быть лишь немного больше 1, [3] что означает, что преломляющие оптические части будет трудно использовать для рентгеновских приложений.
Ранние рентгеновские микроскопы Пола Киркпатрика и Альберта Баэза использовали отражающую рентгеновскую оптику скользящего падения для фокусировки рентгеновских лучей, которые отражали рентгеновские лучи от параболических изогнутых зеркал под очень большим углом падения . Альтернативный метод фокусировки рентгеновских лучей — использование крошечной зонной пластинки Френеля из концентрических колец золота или никеля на подложке из диоксида кремния . Сэр Лоуренс Брэгг получил одни из первых пригодных для использования рентгеновских изображений с помощью своего аппарата в конце 1940-х годов.
В 1950-х годах Стерлинг Ньюберри выпустил теневой рентгеновский микроскоп, в котором образец помещался между источником и целевой пластиной. Это стало основой для первых коммерческих рентгеновских микроскопов компании General Electric .
После периода молчания 1960-х годов рентгеновская микроскопия снова привлекла внимание людей в 1970-х годах. В 1972 году Горовиц и Хауэлл построили первый рентгеновский микроскоп на основе синхротрона в Кембриджском электронном ускорителе. [4] Этот микроскоп сканировал образцы с использованием синхротронного излучения из крошечного отверстия и продемонстрировал возможности как трансмиссионной, так и флуоресцентной микроскопии. Другие разработки этого периода включают первую голографическую демонстрацию Садао Аоки и Сейши Кикута в Японии, [5] первые TXM с использованием зонных пластин Шмаля и др., [6] и эксперименты Стоуни Брука в STXM . [7] [8]
Использование источников синхротронного света открыло новые возможности для рентгеновской микроскопии в 1980-х годах. Однако по мере того, как во многих группах создавались новые микроскопы на основе синхротронных источников, люди поняли, что проводить такие эксперименты сложно из-за недостаточных в то время технологических возможностей, таких как плохое когерентное освещение, некачественные рентгеновские оптические элементы, и неудобные для пользователя источники света. [9]
В 1990-е годы новые инструменты и новые источники света способствовали совершенствованию рентгеновской микроскопии. Были успешно продемонстрированы методы микроскопии, включая томографию, крио- и криотомографию. Благодаря бурному развитию рентгеновская микроскопия нашла новые применения в почвоведении, геохимии, науке о полимерах и магнетизме. Аппаратное обеспечение также было миниатюризировано, чтобы исследователи могли проводить эксперименты в своих собственных лабораториях. [9]
Источники рентгеновского излучения с энергией 9,25 кэВ чрезвычайно высокой интенсивности для рентгеновской фазово-контрастной микроскопии с фокусным пятном размером около 10 × 10 мкм могут быть получены с помощью несинхротронного источника рентгеновского излучения, в котором используется сфокусированный электронный пучок и жидкометаллический анод. Это было продемонстрировано в 2003 году, а в 2017 году было использовано для изображения мозга мыши с размером вокселя около одного кубического микрометра (см. Ниже). [10]
Поскольку области применения продолжают расширяться, рентгеновская микроскопия стала рутинным, проверенным методом, используемым в науках об окружающей среде и почвах, гео- и космохимии, полимерных науках, биологии, магнетизме, материаловедении. В связи с растущим спросом на рентгеновскую микроскопию в этих областях по всему миру создаются микроскопы на основе синхротрона, жидкометаллического анода и других лабораторных источников света. Рентгеновская оптика и компоненты также быстро коммерциализируются. [9]
Усовершенствованный источник света (ALS) в Беркли, Калифорния, является домом для XM-1, полнопольного микроскопа мягкого рентгеновского излучения, эксплуатируемого Центром рентгеновской оптики и предназначенного для различных приложений в современной нанонауке, таких как наномагнитные материалы. , экология, материаловедение и биология. XM-1 использует рентгеновскую линзу для фокусировки рентгеновских лучей на ПЗС-матрице, аналогично оптическому микроскопу. XM-1 установил мировой рекорд по пространственному разрешению с зонными пластинами Френеля размером до 15 нм и способен сочетать высокое пространственное разрешение с временным разрешением менее 100 пс для изучения, например, сверхбыстрой спиновой динамики. В июле 2012 года группа из DESY заявила о рекордном пространственном разрешении в 10 нм, используя сканирующий микроскоп с жестким рентгеновским излучением в PETRA III. [11]
В ALS также находится первый в мире микроскоп мягкого рентгеновского излучения, предназначенный для биологических и биомедицинских исследований. Этот новый прибор XM-2 был спроектирован и изготовлен учеными Национального центра рентгеновской томографии. ХМ-2 способен создавать трехмерные томограммы клеток.
Источники рентгеновского излучения чрезвычайно высокой интенсивности с энергией 9,25 кэВ (K-альфа-линия галлия) для рентгеновской фазово-контрастной микроскопии с фокусным пятном размером около 10 х 10 мкм могут быть получены с помощью источника рентгеновского излучения, в котором используется жидкометаллический галинстановый анод. Это было продемонстрировано в 2003 году. [10] Металл течет из сопла вниз с высокой скоростью, и на него фокусируется источник электронов высокой интенсивности. Быстрый поток металла несет ток, но физический поток предотвращает значительный нагрев анода (из-за принудительно-конвекционного отвода тепла), а высокая температура кипения галинстана препятствует испарению анода. Эта техника была использована для трехмерного изображения мозга мыши с размером вокселя около одного кубического микрометра. [12]
Пригодные для микроскопии источники мягкого рентгеновского излучения, например источники синхротронного излучения, имеют достаточно низкую яркость необходимых длин волн, поэтому альтернативным методом формирования изображения является сканирующая трансмиссионная мягкая рентгеновская микроскопия. Здесь рентгеновские лучи фокусируются в точку, и образец механически сканируется через образовавшееся фокальное пятно. В каждой точке передаваемые рентгеновские лучи регистрируются с помощью детектора, такого как пропорциональный счетчик или лавинный фотодиод . Этот тип сканирующего трансмиссионного рентгеновского микроскопа (STXM) был впервые разработан исследователями из Университета Стоуни-Брук и использовался в Национальном источнике синхротронного света в Брукхейвенской национальной лаборатории .
Разрешение рентгеновской микроскопии находится между разрешением оптического и электронного микроскопа . Его преимущество перед обычной электронной микроскопией заключается в том, что он позволяет просматривать биологические образцы в их естественном состоянии. Электронная микроскопия широко используется для получения изображений с разрешением от нанометра до субангстрема, но относительно толстую живую клетку невозможно наблюдать, поскольку образец необходимо химически зафиксировать, обезвоживать, заключить в смолу, а затем нарезать сверхтонкими срезами. Однако следует отметить, что криоэлектронная микроскопия позволяет наблюдать биологические образцы в их естественном гидратированном состоянии, хотя и заключенные в водяной лед. До сих пор разрешение 30 нанометров возможно с использованием линзы с зональной пластинкой Френеля, которая формирует изображение с помощью мягких рентгеновских лучей, излучаемых синхротроном. В последнее время все более популярным становится использование мягкого рентгеновского излучения, испускаемого лазерной плазмой, а не синхротронного излучения.
Кроме того, рентгеновские лучи вызывают флуоресценцию большинства материалов, и эти излучения можно проанализировать для определения химических элементов изображаемого объекта. Другое применение — создание дифракционных картин — процесс, используемый в рентгеновской кристаллографии . Анализируя внутренние отражения дифракционной картины (обычно с помощью компьютерной программы), можно определить трехмерную структуру кристалла вплоть до размещения отдельных атомов внутри его молекул. Для этих анализов иногда используются рентгеновские микроскопы, поскольку образцы слишком малы для анализа каким-либо другим способом.
Одним из первых применений рентгеновской микроскопии в биологии была контактная визуализация, впервые предложенная Гоби в 1913 году. В этом методе мягкие рентгеновские лучи облучают образец и обнажают чувствительные к рентгеновскому излучению эмульсии под ним. Затем с помощью светового или электронного микроскопа регистрируют увеличенные томографические изображения эмульсий, соответствующие рентгеновским картам непрозрачности образца. Уникальным преимуществом рентгеновской контактной визуализации перед электронной микроскопией была способность отображать влажные биологические материалы. Таким образом, его использовали для изучения микро- и наноструктур растений, насекомых и клеток человека. Однако несколько факторов, в том числе искажения эмульсии, плохие условия освещения и низкое разрешение способов исследования эмульсий, ограничивают разрешение контактной визуализации. Электронное повреждение эмульсий и эффекты дифракции также могут привести к появлению артефактов на конечных изображениях. [13]
Рентгеновская микроскопия имеет свои уникальные преимущества с точки зрения наноразмерного разрешения и высокой проникающей способности, которые необходимы в биологических исследованиях. Благодаря недавнему значительному прогрессу в приборах и фокусировке три классические формы оптики — дифракционная, [14] отражательная, [15] [16] преломляющая [17] оптика — успешно расширились до рентгеновского диапазона и стали использоваться исследовать структуры и динамику на клеточном и субклеточном уровнях. В 2005 году Шапиро и др. сообщили о клеточной визуализации дрожжей с разрешением 30 нм с использованием когерентной мягкой рентгеновской дифракционной микроскопии. [18] В 2008 году была продемонстрирована рентгеновская визуализация неокрашенного вируса. [19] Год спустя дифракция рентгеновских лучей была дополнительно применена для визуализации трехмерной структуры неокрашенной хромосомы человека. [20] Таким образом, рентгеновская микроскопия продемонстрировала свою огромную способность обойти дифракционный предел классических световых микроскопов; однако дальнейшее повышение разрешения ограничено пикселями детектора, оптическими приборами и размерами источника.
Давней серьезной проблемой рентгеновской микроскопии является радиационное повреждение, поскольку рентгеновские лучи высокой энергии производят сильные радикалы и вызывают вредные реакции во влажных образцах. В результате биологические образцы обычно фиксируются или лиофилизируются перед облучением мощными рентгеновскими лучами. Быстрая криообработка также широко используется для сохранения неповрежденных гидратированных структур. [21]
{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ){{cite book}}: CS1 maint: отсутствует местоположение издателя ( ссылка ) CS1 maint: другие ( ссылка )