СТЭД-микроскопия

Микроскопия с истощением стимулированного излучения ( STED ) — один из методов, составляющих микроскопию сверхвысокого разрешения . Он создает изображения сверхвысокого разрешения за счет выборочной деактивации флуорофоров , сводя к минимуму область освещения в фокусной точке и тем самым повышая достижимое разрешение для данной системы. ^[1] Он был разработан Стефаном В. Хеллом и Яном Вихманном в 1994 году, ^[2] и впервые был экспериментально продемонстрирован Хеллом и Томасом Кларом в 1999 году. ^[3] За свою разработку Хелл был удостоен Нобелевской премии по химии в 2014 году. В 1986 г. В.А. Охонин ^[4] (Институт биофизики СО АН СССР, Красноярск) запатентовал идею STED. ^[5] В 1994 году Хелл и Вихманн не знали об этом патенте.

STED-микроскопия — это один из нескольких типов методов микроскопии со сверхвысоким разрешением , которые недавно были разработаны для обхода дифракционного предела световой микроскопии и повышения разрешения. STED — это детерминированный функциональный метод, который использует нелинейный отклик флуорофоров, обычно используемых для маркировки биологических образцов, чтобы добиться улучшения разрешения, то есть STED позволяет получать изображения с разрешением ниже дифракционного предела. Это отличается от стохастических функциональных методов, таких как фотоактивируемая локализационная микроскопия (PALM) и микроскопия стохастической оптической реконструкции (STORM), поскольку эти методы используют математические модели для восстановления субдифракционного предела на основе множества наборов изображений, ограниченных дифракцией.

Фон

В традиционной микроскопии разрешение, которое можно получить, ограничено дифракцией света . Эрнст Аббе разработал уравнение, описывающее этот предел. Уравнение:

\mathrm {D} = {\frac {\lambda }{2n\sin {\alpha }}} = {\frac {\lambda }{\mathrm {2NA} }}

где D — дифракционный предел, λ — длина волны света, а NA — числовая апертура или показатель преломления среды, умноженный на синус угла падения. n описывает показатель преломления образца, α измеряет телесный полуугол, из которого свет собирается объективом, λ — длина волны света, используемая для возбуждения образца, а NA — числовая апертура. Для получения высокого разрешения (т.е. малых значений d) оптимальными являются короткие длины волн и высокие значения числовой апертуры (NA = n sinα). ^[6] Этот дифракционный предел является стандартом, по которому измеряются все методы сверхразрешения. Поскольку STED избирательно деактивирует флуоресценцию, он может обеспечить лучшее разрешение, чем традиционная конфокальная микроскопия. Нормальная флуоресценция возникает путем возбуждения электрона из основного состояния в возбужденное электронное состояние другого фундаментального энергетического уровня (S0 переходит на S1), которое после релаксации обратно в основное состояние (S1) испускает фотон, переходя с S1 на S1. колебательный энергетический уровень на S0. STED прерывает этот процесс до того, как фотон высвободится. Возбужденный электрон вынужден релаксировать в более высокое колебательное состояние, чем мог бы войти флуоресцентный переход, в результате чего высвобождаемый фотон смещается в красную сторону, как показано на изображении справа. ^[7] Поскольку электрон переходит в более высокое колебательное состояние, разница в энергии двух состояний ниже, чем нормальная разница флуоресценции. Это понижение энергии увеличивает длину волны и заставляет фотон смещаться дальше в красный конец спектра. Этот сдвиг различает два типа фотонов и позволяет игнорировать стимулированный фотон.

Чтобы вызвать это альтернативное излучение, падающий фотон должен попасть во флуорофор. Необходимость поразить падающий фотон имеет два значения для STED. Во-первых, количество падающих фотонов напрямую влияет на эффективность этого излучения, а, во-вторых, при достаточно большом количестве фотонов флуоресценция может быть полностью подавлена. ^[8] Чтобы добиться большого количества падающих фотонов, необходимых для подавления флуоресценции, лазер, используемый для генерации фотонов, должен иметь высокую интенсивность. К сожалению, этот лазер высокой интенсивности может привести к фотообесцвечиванию флуорофора . Фотообесцвечивание — это название разрушения флуорофоров светом высокой интенсивности.

Процесс

Сравнение конфокальной микроскопии и STED-микроскопии. Это показывает улучшенное разрешение STED-микроскопии по сравнению с традиционными методами.

Функция STED заключается в уменьшении флуоресценции в определенных областях образца, при этом центральное фокальное пятно остается активным для излучения флуоресценции. Эту фокальную область можно создать, изменив свойства плоскости зрачка объектива. ^[9]^[10]^[11] Наиболее распространенным ранним примером этих дифракционных оптических элементов, или ДОЭ, является форма тора , используемая в двумерном боковом ограничении, показанная ниже. Красная зона истощается, а зеленое пятно остается активным. Этот ДОЭ генерируется круговой поляризацией истощающего лазера в сочетании с оптическим вихрем . Латеральное разрешение этого ДОЭ обычно составляет от 30 до 80 нм. Однако сообщалось о значениях до 2,4 нм. ^[12] При использовании различных ДОЭ было продемонстрировано осевое разрешение порядка 100 нм. ^[13] Модифицированное уравнение Аббе описывает это субдифракционное разрешение как:

$\mathrm {D} = {\frac {\lambda }{2n\sin {\alpha }{\sqrt {1+{\frac {I}{I_{\text{sat}}}}}}} }={\frac {\lambda }{\mathrm {2NA} {\sqrt {1+\sigma }}}}$

Где – показатель преломления среды, – внутрирезонаторная интенсивность, – интенсивность насыщения . Где – коэффициент насыщения, выражающий отношение приложенной (максимальной) интенсивности STED к интенсивности насыщения, . ^[6]^[14] ${\текстовый стиль п}$ ${\текстовый стиль I}$ ${\textstyle I_{\text{сб}}}$ ${\ textstyle \ сигма }$ ${\textstyle \sigma =I_{\text{max}}/I_{\text{сб}}}$

Чтобы оптимизировать эффективность STED, деструктивное вмешательство в центре фокального пятна должно быть как можно ближе к идеальному. Это накладывает определенные ограничения на используемую оптику.

Красители

На ранних этапах разработки STED количество красителей, которые можно было использовать в этом процессе, было очень ограниченным. Родамин Б был назван в первом теоретическом описании STED. ^[2] В результате первые используемые красители были лазерными, излучающими в красном спектре. Чтобы обеспечить STED-анализ биологических систем, красители и лазерные источники должны быть адаптированы к системе. Стремление к лучшему анализу этих систем привело к созданию STED живых клеток и многоцветных STED, но также требовалось все больше и больше совершенных красителей и систем возбуждения для обеспечения возросшей функциональности. ^[7]

Одним из таких достижений стала разработка иммуномеченых клеток. Эти клетки представляют собой флуоресцентные красители STED, связанные с антителами посредством амидных связей. При первом использовании этого метода красный краситель MR-121SE сочетался с вторичным антимышиным антителом. ^[8] С момента первого применения этот метод был применен к гораздо более широкому спектру красителей, включая излучающие зеленый цвет Atto 532, ^[15]^[16]^[17] и излучающий желтый цвет Atto 590, ^[18], а также дополнительные красители, излучающие красный цвет. Кроме того, Atto 647N впервые был использован этим методом для производства двухцветного STED. ^[19]

Приложения

За последние несколько лет STED превратился из сложного и весьма специфического метода в общий флуоресцентный метод. В результате был разработан ряд методов, расширяющих возможности STED и позволяющих предоставлять больше информации.

Структурный анализ

С самого начала STED позволил флуоресцентной микроскопии решать задачи, которые были возможны только с помощью электронной микроскопии. Например, STED использовался для разъяснения анализа структуры белка на уровне суборганелл. Общим доказательством этого уровня исследований является наблюдение цитоскелетных филаментов. Кроме того, нейрофиламенты , актин и тубулин часто используются для сравнения разрешающей способности STED и конфокальных микроскопов. ^[20]^[21]^[22]

Используя STED, латеральное разрешение 70–90 нм было достигнуто при исследовании SNAP25 , человеческого белка, который регулирует слияние мембран. Это наблюдение показало, что SNAP25 формирует кластеры независимо от функциональности мотива SNARE и связывается с кластерным синтаксином. ^[23]^[24] Исследования сложных органелл, таких как митохондрии, также полезны для структурного анализа с помощью STED-микроскопии. С помощью изготовленных на заказ микроскопов STED с латеральным разрешением менее 50 нм было обнаружено, что митохондриальные белки Tom20 , VDAC1 и COX2 распределяются в виде наноразмерных кластеров. ^[25]^[26] В другом исследовании использовалась самодельная STED-микроскопия и ДНК- связывающий флуоресцентный краситель, что позволило измерить длину фрагментов ДНК гораздо точнее, чем традиционные измерения с помощью конфокальной микроскопии . ^[27]

Коррелятивные методы

Благодаря своим функциям STED-микроскопию часто можно использовать с другими методами высокого разрешения. Разрешение как электронной , так и атомно-силовой микроскопии даже лучше, чем разрешение STED, но, объединив атомную силу с STED, Shima et al. смогли визуализировать актиновый цитоскелет клеток рака яичников человека , наблюдая при этом изменения в жесткости клеток. ^[28]

Многоцветный

Многоцветный STED был разработан в ответ на растущую проблему использования STED для изучения зависимости между структурой и функцией белков. Для изучения такого типа сложной системы необходимо использовать как минимум два отдельных флуорофора. Используя два флуоресцентных красителя и пары лучей, возможно колокализованное изображение синаптических и митохондриальных белковых кластеров с разрешением до 5 нм [18]. Многоцветный STED также использовался, чтобы показать, что различные популяции белков синаптических пузырьков не смешивают ускользающие синаптические бутоны. ^[29]^[30] При использовании двухцветного STED с возможностью формирования изображений на протяжении всего срока службы можно получить трехканальный STED.

Живая клетка

Вначале считалось, что STED является полезным методом работы с живыми клетками. ^[13] К сожалению, единственным способом изучения клеток было мечение плазматической мембраны органическими красителями. ^[29] Сочетание STED с флуоресцентной корреляционной спектроскопией показало, что холестерин -опосредованные молекулярные комплексы улавливают сфинголипиды , но только временно. ^[31] Однако только флуоресцентные белки дают возможность визуализировать любую органеллу или белок в живой клетке. Было показано, что этот метод работает при латеральном разрешении 50 нм в клетках млекопитающих, экспрессирующих цитрин-тубулин. ^[32]^[33] Помимо обнаружения структур в клетках млекопитающих, STED позволил визуализировать кластеризацию YFP-меченных PIN-белков в плазматической мембране растительных клеток. ^[34]

Недавно многоцветный STED живых клеток был выполнен с использованием импульсного дальнего красного лазера и экспрессии CLIPf-тегов и SNAPf-тегов. ^[35]

В мозгу интактных животных

Поверхностные слои коры головного мозга мыши можно многократно визуализировать через краниальное окно. ^[36] Это позволяет следить за судьбой и формой отдельных дендритных шипиков в течение многих недель. ^[37] С помощью двухцветного STED можно даже определить наноструктуру постсинаптической плотности у живых животных. ^[38]

STED на видеоскоростях и выше

Для сверхвысокого разрешения требуются маленькие пиксели, что означает больше места для сбора данных в данном образце, что приводит к увеличению времени сбора данных. Однако размер фокусного пятна зависит от интенсивности лазера, используемого для истощения. В результате размер этого пятна можно регулировать, изменяя размер и скорость визуализации. Затем можно достичь компромисса между этими двумя факторами для каждой конкретной задачи визуализации. Была зафиксирована скорость 80 кадров в секунду с фокусными пятнами около 60 нм. ^[1]^[39] Для небольших полей зрения можно достичь скорости до 200 кадров в секунду. ^[40]

Проблемы

Фотообесцвечивание может происходить либо от возбуждения в еще более возбужденное состояние, либо от возбуждения в триплетном состоянии. Чтобы предотвратить возбуждение возбужденного электрона в другое, более высокое возбужденное состояние, энергия фотона, необходимая для запуска альтернативного излучения, не должна перекрывать энергию возбуждения из одного возбужденного состояния в другое. ^[41] Это гарантирует, что каждый лазерный фотон, контактирующий с флуорофорами, будет вызывать стимулированное излучение, а не вызывать возбуждение электрона в другое, более высокоэнергетическое состояние. Триплетные состояния живут гораздо дольше, чем синглетные состояния, и чтобы предотвратить возбуждение триплетных состояний, время между лазерными импульсами должно быть достаточно длительным, чтобы электрон мог релаксировать с помощью другого метода гашения, или следует добавить химическое соединение для гашения триплета. состояние. ^[20]^[42]^[43]

Смотрите также

Внешние ссылки

Викискладе есть медиафайлы по теме STED-микроскопии .

Обзор отдела нанобиофотоники Института биофизической химии Макса Планка .
Краткое изложение уравнений RESOLFT , разработанных Стефаном Хеллом .
Лекция Стефана Хелла: Суперразрешение: обзор и микроскопия с использованием метода стимулированного истощения излучения (STED)
Световая микроскопия: продолжающаяся современная революция (Вводный обзор)