Ячейка с переменной длиной пути

Ячейка с переменной длиной пути — это держатель образца, используемый для ультрафиолетово-видимой спектроскопии или инфракрасной спектроскопии , длина пути которого может изменяться для изменения поглощения без изменения концентрации образца. ^{[1] [2] [3] [4]}

Уравнения

Закон Бера-Ламберта гласит, что существует логарифмическая зависимость между пропусканием (или прозрачностью), T, света через вещество и произведением коэффициента поглощения вещества, α, и расстоянием, которое свет проходит через материал (т. е. длиной пути), ℓ. Коэффициент поглощения , в свою очередь, может быть записан как произведение либо молярной поглощательной способности поглотителя, ε, и концентрации c поглощающих видов в материале, либо поперечного сечения поглощения , σ, и (численной) плотности N поглотителей. (см. ссылку на закон Бера-Ламберта для полного вывода)

Линейность БСА

${\displaystyle A=\varepsilon \ell c}$

Спектроскопия с ячейкой переменной длины пути использует закон Бера-Ламберта для определения концентраций различных растворов . Зная молярную поглощательную способность материала и изменяя длину пути, можно построить график поглощения как функцию длины пути. Смотрите пример графика справа:

Используя линейную регрессию линейного графика выше, можно вывести выражение, связывающее поглощение, A, наклон, m, длину пути и концентрацию.

Можно вывести линейное уравнение двух переменных:

${\displaystyle y=mx+b}$

приравнивая в единицах получаем,

${\displaystyle A=m\ell +b}$

Поскольку наклон линии измеряется в единицах Abs/Pathlength, наклон можно выразить как:

${\displaystyle m={A \over \ell }}$

подставляя в закон Бера, получаем,

${\displaystyle m=\varepsilon c}$

Это уравнение спектроскопии наклона.

Приложения

Методы переменной длины пути могут применяться в любой ситуации, где применим закон Бера. Он обеспечивает аналитический метод, который усредняет незначительные изменения в последовательности подготовки образцов. Он также обеспечивает средства для расчета концентраций без калибровочных кривых или последовательного разбавления образцов.

Спектроскопия поглощения с переменной длиной пути обычно используется, когда необходимы высоковоспроизводимые данные. Это может быть в областях медицины , биотехнологии , фармакологии и разработки лекарств . Это особенно полезно на этапе очистки белков в биотехнологии, где требуются точные концентрации различных белков, или в кристаллографии .

Определение относительного соотношения белка и ДНК является обычной практикой и может быть рассчитано путем нахождения наклона на соответствующих пиках поглощения и взятия их соотношения. Этот метод используется для определения чистоты образца, содержащего эти два типа молекул.

Экспериментальные методы

В ультрафиолетово-видимой спектроскопии или спектроскопии в целом для измерения образцов используется кювета с длиной пути 1 см . Кювета заполняется образцом, свет пропускается через образец и снимаются показания интенсивности. Метод наклонной спектроскопии может применяться с использованием тех же методов, что и в абсорбционной спектроскопии . С появлением точных линейных стадий абсорбционная спектроскопия с переменной длиной пути легко применяется экспериментально.

Другие экспериментальные методы включают использование отношений наклонов для построения спектров коэффициентов экстинкции. Это возможно, поскольку применение спектроскопии наклона позволяет ученому поддерживать уровни концентрации постоянными и изменять длины путей.

Вычитание фона

Базовая линия нет базовой линии

Спектроскопия поглощения с переменной длиной пути использует определенный наклон для расчета концентрации. Как указано выше, это произведение молярной поглощательной способности и концентрации. Поскольку фактическое значение поглощения берется во многих точках данных с равными интервалами, вычитание фона, как правило, не требуется. Изображение справа представляет собой линейный график, показывающий как данные с поправкой на фон, так и необработанные данные.

Это показывает, что значения поглощения на графике смещены на одинаковую величину, а наклон двух графиков одинаков. Таким образом, концентрация, рассчитанная по двум графикам, одинакова. Другие скалярные компоненты, которые вносят вклад в поглощение данного образца, такие как загрязняющие вещества на кювете или другой материал кюветы, также усредняются во время измерения наклона.

Этот метод также применим для линейных измерений в приложениях TFF и хроматографии . ^{[ необходима ссылка ]}

Смотрите также

• Прикладная спектроскопия

Ссылки

1. Тереза ​​Новицкая-Янковская (декабрь 1986 г.). Аналитическая видимая и ультрафиолетовая спектрометрия. Elsevier . стр. 124. ISBN 978-0-444-42371-9.
2. Doucen, R Le; Houdeau, JP; Cousin, C; Menoux, V (1985). «Переменная длина пути, низкотемпературные ячейки для абсорбционной спектроскопии». Journal of Physics E: Scientific Instruments . 18 (3): 199–200. Bibcode : 1985JPhE...18..199L. doi : 10.1088/0022-3735/18/3/007. ISSN  0022-3735.
3. Стюарт, Сара А.; Соммер, Андре Дж. (1999). «Ячейки переменной длины пути для основанного на открытиях исследования закона Бера–Ламберта». Журнал химического образования . 76 (3): 399. Bibcode : 1999JChEd..76..399S. doi : 10.1021/ed076p399. ISSN  0021-9584.
4. Флауэрс, Пол А.; Каллендер, Шерри-Энн (1996). «Ячейка пропускания с переменной длиной пути для ультрафиолетовой, видимой и инфракрасной спектроскопии и спектроэлектрохимии». Аналитическая химия . 68 (1): 199–202. doi :10.1021/ac950580w. ISSN  0003-2700. PMID  21619236.

Дальнейшее чтение

• Thakkar, Santosh V.; Allegre, Kevin M.; Joshi, Sangeeta B.; Volkin, David B.; Middaugh, C. Russell (2012). «Применение ультрафиолетовой спектроскопии для изучения взаимодействий в растворах белков при высоких концентрациях». Журнал фармацевтических наук . 101 (9): 3051–3061. doi :10.1002/jps.23188. ISSN  0022-3549.
• Скотт Хаффман, Кейур Сони и Джо Феррайоло Определение концентрации белка на основе УФ-видимого излучения: проверка и внедрение измерений наклона с использованием технологии переменной длины пути к сентябрю 2014 г. http://www.bioprocessintl.com/manufacturing/antibody-non-antibody/uv-vis-based-determination-protein-concentration-validating-implementing-slope-measurements-using-variable-pathlength-technology/