Флуоресцентный микроскоп полного внутреннего отражения ( TIRFM ) — это тип микроскопа, с помощью которого можно наблюдать тонкую область образца, обычно менее 200 нанометров.
TIRFM — это метод визуализации, который использует возбуждение флуоресцентных клеток в тонком оптическом срезе образца, поддерживаемом на предметном стекле. Этот метод основан на том принципе, что, когда возбуждающий свет полностью отражается внутрь от прозрачного твердого покровного стекла на его границе с жидкой средой, на границе твердого тела и жидкости генерируется электромагнитное поле, также известное как затухающая волна. частота как свет возбуждения. [1] Интенсивность затухающей волны экспоненциально затухает по мере удаления от поверхности твердого тела, так что эффективно возбуждаются только флуоресцентные молекулы в пределах нескольких сотен нанометров от твердого тела. Затем можно получить двумерные изображения флуоресценции, хотя существуют также механизмы, с помощью которых можно получить трехмерную информацию о расположении везикул или структур в клетках. [2]
Широкопольная флуоресценция была представлена в 1910 году и представляла собой оптический метод, освещающий весь образец. [3] Затем в 1960 году была внедрена конфокальная микроскопия, которая уменьшила фон и время экспозиции образца, направляя свет на точку и освещая образец световыми конусами. В 1980-х годах внедрение TIRFM еще больше уменьшило фон и время экспозиции за счет освещения только тонкого среза исследуемого образца. [3]
Существует два распространенных метода создания затухающей волны для TIRFM. [1] Первый метод — призменный, при котором призма направляет лазер к границе раздела между покровным стеклом и средой/клетками под углом падения, достаточным, чтобы вызвать полное внутреннее отражение. Эта конфигурация применялась в клеточной микроскопии более 30 лет, но так и не стала основным инструментом из-за ряда ограничений. Хотя существует множество вариантов конфигурации призмы, большинство из них ограничивают доступ к образцу, что затрудняет выполнение манипуляций, введение среды в пространство образца или проведение физиологических измерений. [2] Еще одним недостатком является то, что в большинстве конфигураций, основанных на конструкциях инвертированных микроскопов, освещение вводится на стороне образца, противоположной оптике объектива, что требует визуализации области затухающего поля через большую часть образца. Для визуализации этой системы требуется большая сложность и точность, а это означало, что метод призмы не использовался многими биологами, а был ограничен физиками.
Другой метод известен как метод объектива, который расширил использование TIRFM в клеточной микроскопии и еще больше увеличился с тех пор, как стало доступно коммерческое решение. [2] В этом механизме можно легко переключаться между стандартной широкопольной флуоресценцией и TIRF, изменяя внеосевое положение фокуса луча в задней фокальной плоскости объектива. Существует несколько разработанных способов изменения положения луча, например, с использованием привода, который может изменять положение относительно флуоресцентного осветителя, прикрепленного к микроскопу.
В клеточной и молекулярной биологии большое количество молекулярных процессов на клеточных поверхностях , таких как клеточная адгезия , связывание клеток гормонами , секреция нейротрансмиттеров и динамика мембран, изучалось с помощью обычных флуоресцентных микроскопов . Однако флуорофоры , связанные с поверхностью образца и в окружающей среде, существуют в равновесном состоянии. Когда эти молекулы возбуждаются и обнаруживаются с помощью обычного флуоресцентного микроскопа, результирующая флуоресценция флуорофоров, связанных с поверхностью, часто подавляется фоновой флуоресценцией из-за гораздо большей популяции несвязанных молекул. TIRFM позволяет избирательно возбуждать связанные с поверхностью флуорофоры, в то время как несвязанные молекулы не возбуждаются и не флуоресцируют. Благодаря субмикронной поверхностной селективности TIRFM стал методом выбора для обнаружения одиночных молекул.
Существует множество применений TIRFM в клеточной микроскопии. Некоторые из этих приложений включают в себя:
Благодаря способности оптически различать отдельные везикулы и напрямую следить за динамикой их взаимодействий, TIRFM дает возможность изучать огромное количество белков, участвующих в нейробиологических процессах, способом, который раньше был невозможен. [2]
TIRFM обеспечивает несколько преимуществ по сравнению со стандартной широкопольной и конфокальной флуоресцентной микроскопией, такие как:
Идея использования полного внутреннего отражения для освещения клеток, контактирующих с поверхностью стекла, была впервые описана Э. Дж. Амброузом в 1956 году. [4] Затем эта идея была развита Дэниелом Аксельродом [5] в Мичиганском университете, Анн-Арбор, в начале 1980-х годов. как ТИРФМ. TIRFM использует затухающую волну для избирательного освещения и возбуждения флуорофоров в ограниченной области образца, непосредственно прилегающей к границе раздела стекло-вода. Затухающее электромагнитное поле экспоненциально затухает от границы раздела и, таким образом, проникает в среду образца на глубину всего лишь примерно 100 нм. Таким образом, TIRFM позволяет избирательно визуализировать поверхностные области клеток, такие как базальная плазматическая мембрана (толщина которой составляет около 7,5 нм). Однако обратите внимание, что ширина визуализируемой области составляет не менее нескольких сотен нанометров, поэтому во время микроскопии TIRF обязательно визуализируется цитоплазматическая зона непосредственно под плазматической мембраной в дополнение к плазматической мембране. Выборочная визуализация плазматической мембраны позволяет визуализировать особенности и события на плазматической мембране живых клеток с высоким осевым разрешением .
TIRF также можно использовать для наблюдения флуоресценции отдельной молекулы , [6] [7], что делает его важным инструментом биофизики и количественной биологии. Микроскопия TIRF также применялась для обнаружения отдельных молекул биомаркеров ДНК и распознавания SNP. [8]
Было показано, что цис-геометрия (сквозная TIRFM) и транс-геометрия (TIRFM на основе призм и световодов) обеспечивают различное качество эффекта полного внутреннего отражения. В случае трансгеометрии путь возбуждения и канал излучения разделены, а в случае TIRFM объективного типа они используют общий объектив и другие оптические элементы микроскопа. Было показано, что геометрия на основе призмы генерирует чистую затухающую волну, экспоненциальное затухание которой близко к теоретически предсказанной функции. [9] Однако в случае объективного TIRFM затухающая волна загрязняется интенсивным рассеянным светом . Показано, что интенсивность рассеянного света составляет 10–15% от затухающей волны, что затрудняет интерпретацию данных, полученных с помощью TIRFM объективного типа [10] [11].
К основным компонентам устройства TIRFM относятся:
Ключевые различия между TIRFM на основе объектива (цис) и TIRFM на основе призмы (транс) заключаются в том, что TIRFM на основе призмы требует использования интерфейса призма/решение для создания исчезающего поля, тогда как TIRFM на основе объектива не требует призмы и использует прикрытие. интерфейс скольжения/решения для генерации исчезающего поля. Обычно более широко используются объективные TIRFM, однако качество изображения у них снижается из-за шума рассеянного света внутри затухающей волны.
TIRFM основан на оптическом явлении полного внутреннего отражения , при котором волны, достигающие границы раздела сред, не передаются в среду 2, а полностью отражаются обратно в среду 1. Полное внутреннее отражение требует, чтобы среда 2 имела более низкий показатель преломления, чем среда 1. , причем волны должны падать на границу раздела под достаточно наклонными углами. Наблюдаемым явлением, сопровождающим полное внутреннее отражение, является затухающая волна , которая пространственно распространяется перпендикулярно от границы раздела в среду 2 и затухает экспоненциально в зависимости от длины волны, показателя преломления и угла падения. Именно затухающая волна используется для достижения повышенного возбуждения флуорофоров вблизи поверхности образца и уменьшения возбуждения лишних флуорофоров внутри раствора.
Для практических целей в TIRF на основе объектива среда 1 обычно представляет собой покровное стекло с высоким показателем преломления, а среда 2 представляет собой образец в растворе с более низким показателем преломления. Между линзой и покровным стеклом может находиться иммерсионное масло для предотвращения значительной рефракции в воздухе.
Критический угол падения возбуждающего света можно получить из закона Снеллиуса :
Для показателя преломления образца – показатель преломления покровного стекла.
Таким образом, когда угол падения достигает , мы начинаем наблюдать эффекты полного внутреннего отражения и затухающей волны, а по мере его превышения эти эффекты становятся более распространенными.
Интенсивность затухающей волны определяется выражением:
При глубине проникновения, определяемой по формуле:
Обычно ≤~100 нанометров, что обычно намного меньше длины волны света и намного тоньше, чем срез конфокального микроскопа . [1] [12]
Для визуализации TIRFM длина волны возбуждающего луча внутри образца может быть выбрана путем фильтрации. Кроме того, диапазон углов падения определяется числовой апертурой (NA) объектива и требует, чтобы NA > . Этот параметр можно регулировать, изменяя угол входа луча возбуждения в объектив. Наконец, коэффициенты отражения ( ) раствора и покровного стекла могут быть определены экспериментально или сообщены производителями.
Для сложных методов флюороскопической микроскопии лазеры являются предпочтительным источником света, поскольку они очень однородны, интенсивны и почти монохроматичны. Однако следует отметить, что источники света ARC LAMP и другие типы источников также могут работать. Обычно длина волны возбуждающего луча определяется требованиями флуорофоров в образце, при этом наиболее распространенные длины волн возбуждения для биологических образцов находятся в диапазоне 400–700 нм .
На практике лайтбокс будет генерировать мультихроматический лазер высокой интенсивности, который затем будет фильтроваться, чтобы пропустить желаемые длины волн для возбуждения образца. Для объективного TIRFM луч возбуждения и луч флуоресцентного излучения будут захватываться через одну и ту же линзу объектива. Таким образом, для разделения лучей используется дихроматическое зеркало, которое отражает входящий луч возбуждения в сторону объектива и позволяет лучу излучения проходить в детектор. Для дальнейшего разделения длин волн излучения и возбуждения может потребоваться дополнительная фильтрация.
При возбуждении светом определенной длины волны флуорофорные красители будут переизлучать свет с более длинными волнами (которые содержат меньше энергии). В контексте TIRFM только флуорофоры, расположенные вблизи границы раздела, будут легко возбуждаться исчезающим полем, тогда как флуорофоры, находящиеся за ~100 нм, будут сильно ослаблены. Свет, излучаемый флуорофорами, будет ненаправленным и, следовательно, будет проходить через линзу объектива в разных местах с различной интенсивностью. Затем этот сигнал пройдет через дихроматическое зеркало и попадет в детектор.
Покровные стекла обычно имеют коэффициент отражения вокруг , в то время как показатель преломления иммерсионного масла является сопоставимым . Воздух с показателем преломления , может вызвать преломление возбуждающего луча между объективом и покровным стеклом, поэтому масло используется для буферизации области и предотвращения лишних межфазных взаимодействий до того, как луч достигнет границы между покровным стеклом и образцом. .
Числовая апертура объектива (NA) определяет диапазон углов, в которых система может принимать или излучать свет.
Для достижения наибольших углов падения желательно пропускать свет под внеосевым углом через периферию линзы.
Задняя фокальная плоскость (также называемая «плоскостью апертуры») — это плоскость, через которую фокусируется возбуждающий луч перед прохождением через объектив. Регулировка расстояния между объективом и BPF может привести к различному увеличению изображения, поскольку угол падения будет становиться меньше или больше крутым. Луч должен пройти через BPF вне оси, чтобы пройти через объектив на его концах, чтобы угол был значительно больше критического угла. Луч также должен быть сфокусирован на BPF, поскольку это гарантирует, что свет, проходящий через объектив, будет коллимирован, взаимодействуя с покровным стеклом под одним и тем же углом и, таким образом, полностью отражаясь внутри. [12]
Образец следует адсорбировать на поверхности предметного стекла и окрасить соответствующими флуорофорами для выявления желаемых свойств образца. Это соответствует протоколу любого другого метода флуоресцентной микроскопии .
Дихроичный фильтр представляет собой краевой фильтр, используемый под наклонным углом падения (обычно 45°) для эффективного отражения света в полосе возбуждения и передачи света в полосе излучения. Угол фильтра 45° разделяет пути луча возбуждения и излучения. Фильтр состоит из сложной системы нескольких слоев металлов, солей металлов и диэлектриков, нанесенных на тонкое стекло в вакууме. [13] Это покрытие имеет высокую отражательную способность для более коротких волн и высокое пропускание для более длинных волн. [14] Хотя фильтр пропускает выбранный возбуждающий свет (более короткую длину волны) через объектив и на плоскость образца, он также пропускает излучаемый флуоресцентный свет (более длинная длина волны) на барьерный фильтр и отражает любой рассеянный возбуждающий свет обратно в направлении лазерного источника. [15] Это максимизирует количество возбуждающего излучения, проходящего через фильтр, и испускаемого луча флуоресценции, который обнаруживается детектором. [16]
Барьерный фильтр в основном блокирует нежелательные длины волн, особенно более короткие волны возбуждающего света. Обычно это полосовой фильтр, который пропускает только волны, излучаемые флуорофором, и блокирует весь нежелательный свет за пределами этой полосы. Более современные микроскопы позволяют менять барьерный фильтр в зависимости от длины волны удельного излучения флуорофора. [13]
Изображение детектируется цифровой камерой с устройством с зарядовой связью (CCD). ПЗС-камеры оснащены детекторами фотонов, которые представляют собой тонкие кремниевые пластины, собранные в двумерные массивы светочувствительных областей. Массивы детекторов захватывают и сохраняют информацию об изображении в виде локализованного электрического заряда, который меняется в зависимости от интенсивности падающего света. [2] Как показано на схеме, фотоны преобразуются детекторами в электроны, а электроны преобразуются в читаемый электрический сигнал на печатной плате. [17] Электрический сигнал затем свертывается с помощью функции рассеяния точки (PSF) для выборки исходного сигнала. Таким образом, разрешение изображения сильно зависит от количества детекторов, и функция рассеяния точки будет определять разрешение изображения. [18]
Большинство методов флуоресцентной визуализации демонстрируют фоновый шум из-за освещения и реконструкции больших срезов (в направлении z) образцов. Поскольку TIRFM использует затухающую волну для флуоресценции тонкого среза образца, фоновый шум и артефакты по своей сути меньше. Однако существуют и другие шумы и артефакты, такие как пуассоновский шум, оптические аберрации, фотообесцвечивание и другие флуоресцентные молекулы.
Пуассоновский шум является фундаментальной неопределенностью при измерении света. Это вызовет неопределенность при обнаружении фотонов флуоресценции. [18] Если в конкретном измерении измеряется N фотонов, существует 63% вероятность того, что истинное среднее значение находится в диапазоне между N +√N и N −√N. [19] Этот шум может привести к искажению изображения объекта в неправильных местоположениях пикселей.
Оптические аберрации могут возникнуть из-за дифракции флуоресцентного света или микроскопа, а также из-за смещения объектива. Дифракция света на предметном стекле может распространить сигнал флуоресценции и привести к размытию извилистых изображений. Аналогичным образом, если существует несовпадение объектива, фильтра и детектора, луч возбуждения или излучения может оказаться не в фокусе и может вызвать размытие изображений. [14]
Фотообесцвечивание может произойти, когда ковалентные или нековалентные связи во флуорофорах разрушаются под действием возбуждающего света и больше не могут флуоресцировать. [20] Флуоресцентные вещества всегда в некоторой степени разлагаются под действием энергии возбуждающего излучения, что приводит к исчезновению флуоресценции и образованию темного размытого изображения. [21] Фотоотбеливание неизбежно, но его можно свести к минимуму, избегая нежелательного воздействия света и используя иммерсионные масла для минимизации рассеяния света. [13]
Автофлуоресценция может возникать в определенных клеточных структурах, где природное соединение в структуре будет флуоресцировать после возбуждения на относительно более коротких длинах волн (аналогично длине волны возбуждения). [18] Индуцированная флуоресценция также может возникать, когда некоторые неавтофлуоресцентные соединения становятся флуоресцентными после связывания с определенными химическими веществами (например, с формальдегидом). [13] Эта флуоресценция может привести к появлению артефактов или фонового шума на изображении. Шум от других флуоресцентных соединений можно эффективно устранить, используя фильтры для улавливания желаемой длины волны флуоресценции или проверив отсутствие автофлуоресцентных соединений в образце.
Современные методы флуоресценции пытаются объединить методы устранения некоторого размытия и шумов. Оптические аберрации, как правило, детерминированы (они постоянны на протяжении всего процесса изображения и для разных образцов). [18] Детерминированное размытие можно устранить путем деконволюции сигнала и вычитания известного артефакта. Метод деконволюции просто использует обратное преобразование Фурье для получения исходного сигнала флуоресценции и удаления артефакта. [19]
Тем не менее было показано, что деконволюция работает только в том случае, если имеется сильный сигнал флуоресценции или когда шум четко определен. Кроме того, деконволюция работает плохо, поскольку она не включает статистическую информацию и не может уменьшить недетерминированный шум, такой как пуассоновский шум. Чтобы получить лучшее разрешение и качество изображения, исследователи использовали статистические методы для моделирования вероятности того, что фотоны могут быть распределены по детектору. [18] [22] Этот метод, называемый методом максимального правдоподобия , в дальнейшем совершенствуется с помощью алгоритмов, повышающих скорость его работы. [22]
{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )