Широкопольная многофотонная микроскопия

Система визуализации, изображающая широкопольный многофотонный микроскоп ^[1]

Широкопольная многофотонная микроскопия ^{[2] [3] [4] [5]} относится к методу оптической нелинейной визуализации, предназначенному для сверхбыстрой визуализации, при котором большая область объекта освещается и отображается без необходимости сканирования. Высокая интенсивность необходима для индукции нелинейных оптических процессов, таких как двухфотонная флуоресценция или генерация второй гармоники . В сканирующих многофотонных микроскопах высокая интенсивность достигается за счет жесткой фокусировки света, а изображение получается за счет сканирования луча. В широкопольной многофотонной микроскопии высокие интенсивности лучше всего достигаются с использованием импульсного лазерного источника с оптическим усилением для достижения большого поля зрения (~ 100 мкм). ^{[2] [3] [4]} Изображение в этом случае получается в виде одного кадра с помощью ПЗС-матрицы без необходимости сканирования, что делает этот метод особенно полезным для одновременной визуализации динамических процессов в интересующем объекте. При использовании широкопольной многофотонной микроскопии частота кадров может быть увеличена до 1000 раз по сравнению с многофотонной сканирующей микроскопией . ^[3] Широкоугольные многофотонные микроскопы пока коммерчески недоступны, но рабочие прототипы существуют в нескольких оптических лабораториях.

Введение

Основной особенностью метода является освещение большой площади образца импульсным лазерным лучом. В нелинейной оптике количество нелинейных фотонов (N), генерируемых импульсным лучом на (освещающую) площадь в секунду, пропорционально ^{[6] [7]}

${\displaystyle N\varpropto {\frac {E^{2}}{\tau A}}f}$,

где E — энергия луча в Джоулях, τ — длительность импульса в секундах, A — освещающая площадь в квадратных метрах, f — частота следования импульсного луча в Герцах. Таким образом, увеличение площади освещения уменьшает количество генерируемых нелинейных фотонов, если только энергия не увеличивается. Оптические повреждения зависят от плотности энергии, т.е. пиковой интенсивности на площадь I _p =E/(τA). Следовательно, и площадь, и энергию можно легко увеличить без риска оптического повреждения, если пиковую интенсивность на площадь поддерживать низкой, и при этом можно получить выигрыш в количестве генерируемых нелинейных фотонов за счет квадратичной зависимости. Например, увеличение площади и энергии в 1000 раз оставляет пиковую интенсивность неизменной, но увеличивает количество генерируемых нелинейных фотонов в 1000 раз. Эти 1000 дополнительных фотонов действительно генерируются на большей площади. При визуализации это означает, что дополнительные 1000 фотонов распределяются по изображению, что на первый взгляд может показаться не преимуществом перед многофотонной сканирующей микроскопией. Однако преимущество становится очевидным, если принять во внимание размер изображения и время сканирования. ^[3] Количество нелинейных фотонов на кадр изображения в секунду, генерируемых широкопольным многофотонным микроскопом по сравнению с сканирующим многофотонным микроскопом, определяется выражением ^[3]

${\displaystyle {\frac {N_{\mathrm {wide-field} }}{N_{\mathrm {scanning} }}}=n{\frac {f_{\mathrm {wide-field} }}{f_{\mathrm {scanning} }}}}$,

если предположить, что в обеих системах используется одинаковая пиковая интенсивность. Здесь n — количество точек сканирования таких, что . ${\textstyle A_{\mathrm {wide-field} }=nA_{\mathrm {scanning} }}$

Ограничения

• Этот метод не подходит для визуализации глубоких тканей (например, головного мозга), поскольку качество изображения быстро ухудшается с увеличением глубины.
• Предел, до которого можно увеличить энергию, зависит от лазерной системы. Оптические усилители, такие как регенеративный усилитель , обычно могут выдавать энергию до мДж с более низкой частотой повторения по сравнению с системами на основе генераторов (например, Ti:сапфировый лазер ).
• Возможна поломка оптики, если луч каким-то образом фокусируется где-то в оптической системе на небольшой площади. Существуют разные методы достижения необходимой освещенности без риска повреждения оптики (см. Методы).
• Разрез по глубине может отсутствовать.

Преимущества

• Сверхбыстрая визуализация. Для создания одного изображения необходим один лазерный выстрел. Таким образом, частота кадров ограничивается частотой повторения лазерной системы или частотой кадров ПЗС-камеры.
• Меньшее повреждение клеток. В водных системах (таких как клетки) частота повторения от средней до низкой (1–200 кГц) обеспечивает термодиффузию между импульсами освещения, поэтому порог повреждения выше, чем при высокой частоте повторения (80 МГц). ^{[8] [9]}
• Весь объект можно наблюдать одновременно благодаря широкоугольному освещению.
• Большая глубина проникновения при биологической визуализации по сравнению с однофотонной флуоресценцией из-за требуемых более длинных волн.
• Более высокое разрешение, чем у широкопольной однофотонной флуоресцентной микроскопии. Оптическое разрешение может быть сравнимо или лучше, чем у многофотонных сканирующих микроскопов.

Методы

Существует техническая сложность достижения большой площади освещения без разрушения отображающей оптики. Одним из подходов является так называемая пространственно-временная фокусировка ^{[4] [5]} , при которой импульсный луч пространственно рассеивается с помощью дифракционной решетки, образуя «радужный» луч, который впоследствии фокусируется объективной линзой. ^[5] Эффект фокусировки «радужного» луча при визуализации дифракционной решетки приводит к перекрытию волн разной длины в фокальной плоскости объектива. Тогда разные длины волн интерферируют только в перекрывающемся объеме, если не вводится дополнительная пространственная или временная дисперсия, так что интенсивное импульсное освещение восстанавливается и способно давать изображения поперечного сечения. Осевое разрешение обычно составляет 2–3 мкм ^{[4] [5]} даже при использовании методов структурированного освещения. ^{[10] [11]} Пространственная дисперсия, создаваемая дифракционной решеткой, обеспечивает распространение энергии лазера по более широкой области линзы объектива, что снижает вероятность повреждения самой линзы.

В отличие от того, что первоначально предполагалось, временная фокусировка удивительно устойчива к рассеянию. ^[12] Его способность проникать через мутные среды с минимальными спеклами использовалась в оптогенетике , позволяя фотовозбуждать произвольные световые узоры через ткани. ^[12] Позднее временная фокусировка была объединена с однопиксельным обнаружением, чтобы преодолеть эффект рассеяния на флуоресцентных фотонах. ^[13] Этот метод, названный TRAFIX, позволил получить широкоугольную визуализацию биологических тканей на больших глубинах с более высоким соотношением сигнал/фон и меньшим фотообесцвечиванием, чем стандартная двухфотонная микроскопия с точечным сканированием . ^[13]

Другой, более простой метод состоит из двух лучей, которые слабо фокусируются и перекрываются на участке (~ 100 мкм) образца. ^{[2] [3]} С помощью этого метода можно получить доступ ко всем элементам тензора благодаря возможности изменять поляризацию каждого луча независимо. ${\displaystyle \chi ^{(2)}}$

Рекомендации

1. Масиас-Ромеро, Карлос; Дидье, Мари Э.П.; Журден, Паскаль; Марке, Пьер; Маджистретти, Пьер; Тарун, Орли Б.; Зубков, Виталий; Раденович, Александра ; Рок, Сильви (15 декабря 2014 г.). «Высокопроизводительная визуализация второй гармоники для биологических приложений без меток» (PDF) . Оптика Экспресс . 22 (25): 31102–12. дои : 10.1364/oe.22.031102 . ISSN  1094-4087. ПМИД  25607059.
2. Петерсон, Марк Д.; Хейс, Патрик Л.; Мартинес, Имее Су; Касс, Лаура С.; Ахтил, Дженнифер Л.; Вайс, Эмили А.; Гейгер, Франц М. (1 мая 2011 г.). «Визуализация генерации второй гармоники с помощью усилителя кГц [Приглашен]». Оптические материалы Экспресс . 1 (1): 57. дои :10.1364/ome.1.000057.
3. Масиас-Ромеро, Карлос; Дидье, Мари Э.П.; Журден, Паскаль; Марке, Пьер; Маджистретти, Пьер; Тарун, Орли Б.; Зубков, Виталий; Раденович, Александра ; Рок, Сильви (15 декабря 2014 г.). «Высокопроизводительная визуализация второй гармоники для биологических приложений без меток» (PDF) . Оптика Экспресс . 22 (25): 31102. doi : 10.1364/oe.22.031102 . ПМИД  25607059.
4. Ченг, Ли-Чунг; Чанг, Цзя-Юань; Лин, Чун-Ю; Чо, Кенг-Чи; Йен, Вэй-Чунг; Чанг, Нань-Шань; Сюй, Крис; Донг, Чэнь Юань; Чен, Шан-Джен (9 апреля 2012 г.). «Широкопольная многофотонная микроскопия на основе пространственно-временной фокусировки для быстрого получения оптических срезов». Оптика Экспресс . 20 (8): 8939–48. дои : 10.1364/oe.20.008939 . ПМИД  22513605.
5. Орон, Дэн; Таль, Эран; Зильберберг, Ярон (7 марта 2005 г.). «Бессканирующая микроскопия с глубинным разрешением». Оптика Экспресс . 13 (5): 1468–76. дои : 10.1364/opex.13.001468 . ПМИД  19495022.
6. Шен, Ю.Р. (9 февраля 1989 г.). «Свойства поверхности, исследованные методами генерации второй гармоники и суммарной частоты». Природа . 337 (6207): 519–525. дои : 10.1038/337519a0. S2CID  4233043.
7. Дадап, Джи; Ху, XF; Рассел, М.; Экердт, Дж.Г.; Лоуэлл, Дж. К.; Даунер, MC (1 декабря 1995 г.). «Анализ генерации второй гармоники неусиленными ультракороткими лазерными импульсами с высокой частотой повторения на границах раздела Si (001)». Журнал IEEE по избранным темам квантовой электроники . 1 (4): 1145–1155. дои : 10.1109/2944.488693. ISSN  1077-260X.
8. Масиас-Ромеро, К.; Зубков В.; Ван, С.; Рок, С. (01 апреля 2016 г.). «Широкопольная многофотонная микроскопия со средней частотой повторения уменьшает фотоповреждения живых клеток». Биомедицинская оптика Экспресс . 7 (4): 1458–1467. дои : 10.1364/боэ.7.001458. ISSN  2156-7085. ПМЦ 4929654 . ПМИД  27446668. 
9. Харзич, Р. Ле; Риман, И.; Кениг, К.; Вюлльнер, К.; Доницкий, К. (1 декабря 2007 г.). «Влияние фемтосекундного лазерного импульсного облучения на жизнеспособность клеток при длинах волн 1035, 517 и 345 нм». Журнал прикладной физики . 102 (11): 114701. дои : 10.1063/1.2818107 . ISSN  0021-8979.
10. Чхве, Хиджин; Да, Элайджа Ю.С.; Халлакоглу, Бертан; Фантини, Серджио; Шеппард, Колин-младший; Итак, Питер ТС (01.07.2013). «Улучшение осевого разрешения и контраста во временно-сфокусированной широкопольной двухфотонной микроскопии со структурированным световым освещением». Биомедицинская оптика Экспресс . 4 (7): 995–1005. дои : 10.1364/бнэ.4.000995. ПМК 3704103 . ПМИД  23847726. 
11. Да, Элайджа Ю.С.; Чхве, Хиджин; Ким, Тэкын; Итак, Питер ТС (01.01.2011). «Широкопольная двухфотонная микроскопия с временной фокусировкой и подавлением фона HiLo». В Периасами, Аммаси; Кениг, Карстен; Итак, Питер Т.С. (ред.). Многофотонная микроскопия в биомедицинских науках XI . Том. 7903. С. 79031O–79031O–6. дои : 10.1117/12.876068. hdl : 1721.1/120979. S2CID  120466973.
12. Папагиакуму, Эйрини; Бег, Орельен; Лешем, Бен; Шварц, Осип; Стелл, Брэндон М.; Брэдли, Джонатан; Орон, Дэн; Эмилиани, Валентина (17 февраля 2013 г.). «Функциональное паттерновое многофотонное возбуждение глубоко внутри рассеивающей ткани» (PDF) . Природная фотоника . 7 (4): 274–278. дои : 10.1038/nphoton.2013.9. ISSN  1749-4885.
13. Эскобет-Монтальбан, Адриа; Спесивцев Роман; Чен, Минчжоу; Сабер, Вардия Афшар; Эндрюс, Мелисса; Херрингтон, К. Саймон; Мазилу, Майкл; Дхолакия, Кишан (01 октября 2018 г.). «Многофотонная визуализация в широком поле через рассеивающие среды без коррекции». Достижения науки . 4 (10): eaau1338. arXiv : 1712.07415 . doi : 10.1126/sciadv.aau1338. ISSN  2375-2548. ПМК 6184782 . ПМИД  30333995.