Деградация Эдмана , разработанная Пером Эдманом , представляет собой метод секвенирования аминокислот в пептиде . [1] В этом методе аминоконцевой остаток маркируется и отщепляется от пептида, не нарушая пептидных связей между другими аминокислотными остатками.
Фенилизотиоцианат реагирует с незаряженной N-концевой аминогруппой в слабощелочных условиях с образованием циклического фенилтиокарбамоильного производного. Затем в кислых условиях это производное конечной аминокислоты расщепляется как производное тиазолинона. Затем аминокислота тиазолинона селективно экстрагируется в органический растворитель и обрабатывается кислотой с образованием более стабильного производного аминокислоты фенилтиогидантоина (PTH), которое можно идентифицировать с помощью хроматографии или электрофореза . Затем эту процедуру можно повторить снова, чтобы идентифицировать следующую аминокислоту. Основным недостатком этого метода является то, что пептиды, секвенируемые таким образом, не могут иметь более 50-60 остатков (а на практике менее 30). Длина пептида ограничена из-за того, что циклическая дериватизация не всегда доходит до конца. Проблема дериватизации может быть решена путем расщепления больших пептидов на более мелкие пептиды перед продолжением реакции. Он способен точно секвенировать до 30 аминокислот с помощью современных машин, способных обеспечить эффективность более 99% на аминокислоту . Преимущество деградации Эдмана заключается в том, что для процесса секвенирования используется всего 10–100 пикомолей пептида . Реакция деградации Эдмана была автоматизирована в 1967 году Эдманом и Беггсом для ускорения процесса [2] , и к 1973 году во всем мире использовалось 100 автоматизированных устройств. [3]
Поскольку деградация Эдмана происходит с N-конца белка, она не будет работать, если N-конец был химически модифицирован (например, путем ацетилирования или образования пироглутаминовой кислоты ). Секвенирование остановится, если встретится не-α-аминокислота (например, изоаспарагиновая кислота ), поскольку предпочтительный промежуточный пятичленный цикл не может быть образован. Деградация Эдмана, как правило, бесполезна для определения положений дисульфидных мостиков. Для нее также требуются количества пептида в 1 пикомоль или выше для различимых результатов. [ необходима цитата ]
После 2D SDS PAGE белки могут быть перенесены на поливинилидендифторидную (PVDF) блоттинговую мембрану для дальнейшего анализа. Деградации Эдмана могут быть выполнены непосредственно с мембраны PVDF. Секвенирование N-концевого остатка, приводящее к получению от пяти до десяти аминокислот, может быть достаточным для идентификации интересующего белка (POI). [ необходима цитата ]