Акридиновый оранжевый представляет собой органическое соединение , которое служит селективным флуоресцентным красителем нуклеиновых кислот с катионными свойствами, полезными для определения клеточного цикла. Акридиновый оранжевый проницаем для клеток, что позволяет красителю взаимодействовать с ДНК путем интеркаляции или с РНК посредством электростатического притяжения . При связывании с ДНК акридиновый оранжевый очень похож по спектру на органическое соединение, известное как флуоресцеин. Акридиновый оранжевый и флуоресцеин имеют максимальное возбуждение при 502 нм и 525 нм (зеленый). Когда акридиновый оранжевый связывается с РНК, флуоресцентный краситель испытывает максимальный сдвиг возбуждения от 525 нм (зеленый) до 460 нм (синий). Сдвиг максимального возбуждения также приводит к максимальному излучению 650 нм (красный). Акридиновый оранжевый способен выдерживать среду с низким pH, позволяя флуоресцентному красителю проникать в кислые органеллы, такие как лизосомы и фаголизосомы, которые представляют собой мембраносвязанные органеллы, необходимые для кислотного гидролиза или для производства продуктов фагоцитоза апоптотических клеток. Акридиновый оранжевый используется в эпифлуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии . Способность проникать через клеточные мембраны кислых органелл и катионные свойства акридинового оранжевого позволяют красителю различать различные типы клеток (т. е. бактериальные клетки и лейкоциты). Сдвиг максимальных длин волн возбуждения и излучения дает основу для прогнозирования длины волны, при которой клетки будут окрашиваться. [1]
При pH среды 3,5 акридиновый оранжевый возбуждается синим светом (460 нм). Когда акридиновый оранжевый возбуждается синим светом, флуоресцентный краситель может по-разному окрашивать клетки человека в зеленый цвет, а клетки прокариот в оранжевый (600 нм), что позволяет быстро обнаружить его с помощью флуоресцентного микроскопа. Способность дифференцированного окрашивания акридиновым оранжевым обеспечивает быстрое сканирование мазков образцов при меньшем увеличении в 400 раз по сравнению с окрашиванием по Граму , которое работает при 1000-кратном увеличении. Дифференцировке клеток способствует темный фон, который позволяет легко обнаружить цветные организмы. Резкий контраст обеспечивает механизм подсчета количества организмов, присутствующих в образце. Когда акридиновый оранжевый связывается с ДНК, краситель демонстрирует максимальное возбуждение при длине волны 502 нм, обеспечивая максимальное излучение при длине волны 525 нм. При связывании с РНК акридиновый оранжевый демонстрирует максимальное значение эмиссии 650 нм и максимальное значение возбуждения 460 нм. Максимальная величина возбуждения и эмиссии, возникающая при связывании акридинового оранжевого с РНК, является результатом электростатических взаимодействий и интеркаляции между молекулой акридина и парами нуклеиновых кислот и оснований, присутствующими в РНК и ДНК. [2]
Акридиновые красители получают конденсацией 1,3-диаминобензола с подходящими бензальдегидами. Акридиновый оранжевый получают из диметиламинобензальдегида и N , N - диметил-1,3-диаминобензола. [3] Его также можно получить по реакции Эшвейлера-Кларка с 3,6-акридиндиамином.
Акридиновый оранжевый является производным органической молекулы акридина, которая была впервые открыта Карлом Грабе и Генрихом Каро, которые выделили акридин путем кипячения угля в Германии в конце девятнадцатого века. Акридин обладает противомикробными факторами, полезными для бактерий, устойчивых к лекарствам, и для изоляции бактерий в различных средах. [4] Акридиновый оранжевый в середине двадцатого века использовался для изучения микробного состава почвы и прямого подсчета водных бактерий. Кроме того, метод прямого подсчета акридинового оранжевого (AODC) оказался полезным при подсчете бактерий, обнаруженных на свалках. Метод прямой эпифлуоресцентной фильтрации (DEFT) с использованием акридинового оранжевого — это метод, известный для исследования содержания микробов в пище и воде. Использование акридинового оранжевого в клинических целях получило широкое признание, в основном с упором на выделение бактерий в культурах крови. Прошлые и настоящие исследования, сравнивающие окрашивание акридиновым оранжевым со слепыми субкультурами для обнаружения положительных культур крови, показали, что акридиновый оранжевый представляет собой простую, недорогую и быструю процедуру окрашивания, которая, по-видимому, более чувствительна, чем окраска по Граму, для обнаружения микроорганизмов в спинномозговой жидкости и других клинические и доклинические материалы. [3]
Акридиновый оранжевый получил широкое признание и используется во многих различных областях, таких как эпифлуоресцентная микроскопия и оценка качества хроматина сперматозоидов . Акридиновый оранжевый полезен при быстром скрининге обычно стерильных образцов. Когда акридиновый оранжевый используется с проточной цитометрией, дифференциальное окрашивание используется для измерения денатурации ДНК [5] и клеточного содержания ДНК по сравнению с РНК [6] в отдельных клетках или обнаружения повреждения ДНК в бесплодных сперматозоидах. [7] Акридиновый оранжевый рекомендуется использовать для флюоресцентно-микроскопического обнаружения микроорганизмов в мазках, приготовленных из клинических и доклинических материалов. Окрашивание акридиновым оранжевым необходимо проводить при кислом pH , чтобы получить дифференциальное окрашивание, которое позволяет бактериальным клеткам окрашиваться в оранжевый цвет, а тканевые компоненты окрашиваться в желтый или зеленый цвет. [8]
Акридиновый оранжевый также используется для окрашивания кислых вакуолей ( лизосом , эндосом и аутофагосом ), РНК и ДНК в живых клетках. Этот метод является дешевым и простым способом изучения лизосомальной вакуолизации , аутофагии и апоптоза . Цвет эмиссии акридинового оранжевого меняется с желтого на оранжевый и красный по мере падения pH в кислой вакуоли живой клетки. При определенных условиях ионной силы и концентрации акридиновый оранжевый излучает красную флуоресценцию, когда он связывается с РНК путем пакетных взаимодействий, и зеленую флуоресценцию, когда он связывается с ДНК путем интеркаляции . В зависимости от концентрации акридинового оранжевого ядра могут излучать желтовато-зеленую флуоресценцию в необработанных клетках и зеленую флуоресценцию, когда синтез РНК ингибируется такими соединениями, как хлорохин . [9] Акридиновый оранжевый можно использовать в сочетании с бромистым этидием или йодидом пропидия для дифференциации жизнеспособных, апоптотических и некротических клеток. Кроме того, акридиновый оранжевый можно использовать в образцах крови, вызывая флуоресценцию бактериальной ДНК , что помогает в клинической диагностике бактериальных инфекций, таких как менингит. [3]