Бромистый этидий (или бромистый этидий , [2] хлоридная соль хлорида гомидия ) [3] [4] является интеркалирующим агентом, обычно используемым в качестве флуоресцентной метки ( окрашивания нуклеиновых кислот ) в лабораториях молекулярной биологии для таких методов, как электрофорез в агарозном геле . Его обычно сокращают до EtBr , что также является сокращением от бромэтана . Чтобы избежать путаницы, некоторые лаборатории использовали сокращение EthBr для этой соли. При воздействии ультрафиолетового света он будет флуоресцировать оранжевым цветом, усиливаясь почти в 20 раз после связывания с ДНК . Под названием гомидий он широко использовался с 1950-х годов в ветеринарной медицине для лечения трипаносомоза у крупного рогатого скота. [5] Высокая частота возникновения устойчивости к противомикробным препаратам делает это лечение непрактичным в некоторых областях, где вместо него используется родственный хлорид изометамидия . Несмотря на свою репутацию мутагена, тесты показали, что он обладает низкой мутагенностью без метаболической активации. [6] [7]
Как и большинство флуоресцентных соединений , бромистый этидий является ароматическим . Его основная гетероциклическая часть известна как фенантридин , изомер которого является флуоресцентным красителем акридином . Максимумы поглощения EtBr в водном растворе находятся при 210 нм и 285 нм, что соответствует ультрафиолетовому свету . В результате этого возбуждения EtBr испускает оранжевый свет с длиной волны 605 нм. [8] [9]
Интенсивная флуоресценция бромистого этидия после связывания с ДНК, вероятно, не является следствием жесткой стабилизации фенильной части , поскольку было показано, что фенильное кольцо выступает за пределы интеркалированных оснований. Фактически, фенильная группа оказывается почти перпендикулярной плоскости кольцевой системы, поскольку она вращается вокруг своей одинарной связи, чтобы найти положение, в котором она будет минимально соприкасаться с кольцевой системой. Вместо этого, как полагают, ответственна гидрофобная среда, находящаяся между парами оснований . Перемещаясь в эту гидрофобную среду и удаляясь от растворителя, катион этидия вынужден сбрасывать любые молекулы воды, которые были связаны с ним. Поскольку вода является высокоэффективным гасителем флуоресценции , удаление этих молекул воды позволяет этидию флуоресцировать. [ необходима цитата ]
Бромистый этидий обычно используется для обнаружения нуклеиновых кислот в лабораториях молекулярной биологии. В случае ДНК это обычно двухцепочечная ДНК из ПЦР , рестрикционных гидролизов и т. д. Одноцепочечная РНК также может быть обнаружена, поскольку она обычно сворачивается сама на себя и, таким образом, обеспечивает локальное спаривание оснований для интеркаляции красителя. Обнаружение обычно включает гель, содержащий нуклеиновые кислоты, помещенный на или под ультрафиолетовую лампу. Поскольку ультрафиолетовый свет вреден для глаз и кожи, гели, окрашенные бромистым этидием, обычно просматриваются косвенно с помощью закрытой камеры, а флуоресцентные изображения записываются в виде фотографий. Когда требуется прямой просмотр, глаза и открытая кожа наблюдателя должны быть защищены. В лаборатории интеркалирующие свойства давно используются для минимизации хромосомной конденсации, когда культура подвергается воздействию митотических задерживающих агентов во время сбора. Полученные препараты на предметных стеклах обеспечивают более высокую степень разрешения и, следовательно, большую уверенность в определении структурной целостности хромосом при микроскопическом анализе. [ необходима ссылка ]
Бромистый этидий также используется при разделении фрагментов ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле . [10] Он добавляется в рабочий буфер и связывается путем интеркаляции между парами оснований ДНК. Когда агарозный гель освещается УФ-светом, полосы ДНК становятся видимыми. Интеркаляция EtBr может изменять свойства молекулы ДНК, такие как заряд, вес, конформация и гибкость. Поскольку подвижности молекул ДНК через агарозный гель измеряются относительно стандарта молекулярной массы, эффекты EtBr могут иметь решающее значение для определения размеров молекул. [11]
Бромистый этидий также широко использовался для снижения числа копий митохондриальной ДНК в пролиферирующих клетках. [12] Влияние EtBr на митохондриальную ДНК используется в ветеринарии для лечения трипаносомоза у крупного рогатого скота, поскольку EtBr связывает молекулы кинетопластидной ДНК и изменяет их конформацию в форму Z-ДНК . Эта форма ингибирует репликацию кинетопластидной ДНК, что является смертельным для трипаносом. [13]
Хлоридная соль гомидия хлорид имеет те же применения. [3] [4]
Бромистый этидий можно добавлять в среду YPD и использовать в качестве ингибитора роста клеток. [14]
Сродство связывания катионных наночастиц с ДНК можно оценить с помощью конкурентного связывания с бромистым этидием. [15] [16]
Существуют альтернативы бромистому этидию, которые рекламируются как менее опасные и обладающие лучшими характеристиками. [17] [18] Например, некоторые исследователи используют несколько красителей на основе SYBR , и есть другие новые красители, такие как «Novel Juice». Красители SYBR менее мутагенные, чем EtBr, по результатам теста Эймса с экстрактом печени. [19] Однако было обнаружено, что SYBR Green I на самом деле более мутагенный, чем EtBr, для бактериальных клеток, подвергаемых воздействию УФ-излучения (которое используется для визуализации любого красителя). [20] Это может быть и в случае других «более безопасных» красителей, но, хотя сведения о мутагенности и токсичности доступны [21], они не были опубликованы в рецензируемых журналах. В MSDS для SYBR Safe сообщается о LD 50 для крыс более 5 г/кг, что выше, чем у EtBr (1,5 г/кг). Многие альтернативные красители суспендируются в ДМСО , что само по себе имеет последствия для здоровья, включая повышенную абсорбцию кожей органических соединений. [19] Несмотря на преимущество в производительности при использовании красителей SYBR вместо EtBr для окрашивания, многие исследователи по-прежнему предпочитают EtBr, поскольку он значительно дешевле. [ необходима цитата ]
Большинство случаев использования бромистого этидия в лабораторных условиях (0,25–1 мкг/мл) ниже дозировки LD50, что делает острую токсичность маловероятной. Для полного понимания долгосрочного риска, который представляет бромистый этидий для работников лабораторий, потребуются испытания на людях и более длительные исследования в системе млекопитающих, но очевидно, что бромистый этидий может вызывать мутации в клетках млекопитающих и бактерий. [22]
Этидий бромистый не регулируется как опасные отходы при низких концентрациях, [23] но рассматривается как опасные отходы многими организациями. Материал должен обрабатываться в соответствии с паспортом безопасности (SDS) производителя . [ необходима цитата ]
Утилизация лабораторного бромистого этидия остается спорным вопросом. [24] Бромистый этидий можно разложить химическим способом или собрать и сжечь. Обычно отходы бромистого этидия ниже установленной концентрации утилизируют обычным способом (например, сливают в канализацию). Обычной практикой является обработка бромистого этидия гипохлоритом натрия (отбеливатель) перед утилизацией. [25] По словам Ланна и Сансона, химическое разложение с использованием отбеливателя дает соединения, которые являются мутагенными по тесту Эймса . Данные о мутагенных эффектах продуктов разложения отсутствуют. Ланн и Сансон описывают более эффективные методы разложения. [26] В других местах рекомендуется удаление бромистого этидия из растворов с помощью активированного угля или ионообменной смолы . [27] Для этого доступны различные коммерческие продукты. [28]
Трипаносомы в долине реки Гибе на юго-западе Эфиопии продемонстрировали всеобщую устойчивость в период с июля 1989 года по февраль 1993 года. [29] Это, вероятно, указывает на постоянную потерю функции в этой области против протестированной цели, T. congolense, выделенной от крупного рогатого скота породы боран . [29]
Медиа, связанные с бромистым этидием на Wikimedia Commons