Z-ДНК — одна из многих возможных двойных спиральных структур ДНК . Это левозакрученная двойная спиральная структура, в которой спираль закручивается влево зигзагом, а не вправо, как в более распространенной форме B-ДНК . Считается, что Z-ДНК — одна из трех биологически активных двойных спиральных структур наряду с A-ДНК и B-ДНК .
Левосторонняя ДНК была впервые предложена Робертом Уэллсом и его коллегами как структура повторяющегося полимера инозина – цитозина . [ 1] Они наблюдали «обратный» спектр кругового дихроизма для таких ДНК и неверно интерпретировали это как то, что нити обернуты вокруг друг друга в левостороннем порядке. Связь между Z-ДНК и более привычной B-ДНК была указана в работе Поля и Джовина, [2] которые показали , что ультрафиолетовый круговой дихроизм поли(dG-dC) был почти инвертирован в 4 M растворе хлорида натрия и что структура поли d(I–C)·поли d(I–C) на самом деле была правосторонней конформацией D-ДНК. Подозрение, что это было результатом преобразования из B-ДНК в Z-ДНК, было подтверждено путем изучения спектров Рамана этих растворов и кристаллов Z-ДНК. [3] Впоследствии была опубликована кристаллическая структура «Z-ДНК», которая оказалась первой монокристаллической рентгеновской структурой фрагмента ДНК (самокомплементарного гексамера ДНК d(CG) 3 ). Она была разрешена как левозакрученная двойная спираль с двумя антипараллельными цепями, которые удерживались вместе парами оснований Уотсона-Крика (см. рентгеновскую кристаллографию ). Она была решена Эндрю Х. Дж. Вангом , Александром Ричем и их коллегами в 1979 году в Массачусетском технологическом институте . [4] Кристаллизация соединения B-Z-ДНК в 2005 году [5] обеспечила лучшее понимание потенциальной роли, которую Z-ДНК играет в клетках. Всякий раз, когда формируется сегмент Z-ДНК, на двух его концах должны быть соединения B–Z, связывающие его с B-формой ДНК, обнаруженной в остальной части генома .
В 2007 году РНК- версия Z-ДНК, Z-РНК , была описана как трансформированная версия двойной спирали A-РНК в левую спираль. [6] Однако переход от A-РНК к Z-РНК был описан еще в 1984 году. [7]
Z-ДНК довольно сильно отличается от правозакрученных форм. Фактически, Z-ДНК часто сравнивают с B-ДНК, чтобы проиллюстрировать основные различия. Спираль Z-ДНК левозакрученная и имеет структуру, которая повторяет каждую вторую пару оснований. Большая и малая бороздки, в отличие от A- и B-ДНК, показывают небольшую разницу в ширине. Формирование этой структуры, как правило, неблагоприятно, хотя определенные условия могут способствовать этому; такие как чередующаяся последовательность пурина и пиримидина (особенно поли(dGC) 2 ), отрицательная суперспирализация ДНК или высокое содержание соли и некоторых катионов (все при физиологической температуре, 37 °C и pH 7,3–7,4). Z-ДНК может образовывать соединение с B-ДНК (называемое «соединительной коробкой B-to-Z») в структуре, которая включает выдавливание пары оснований. [8] Конформацию Z-ДНК было трудно изучать, поскольку она не существует как стабильная особенность двойной спирали. Вместо этого это временная структура, которая время от времени индуцируется биологической активностью, а затем быстро исчезает. [9]
Можно предсказать вероятность того, что последовательность ДНК образует структуру Z-ДНК. Алгоритм для предсказания склонности ДНК к переключению из B-формы в Z-форму, ZHunt , был написан П. Шинг Хо в 1984 году в Массачусетском технологическом институте . [10] Этот алгоритм был позже разработан Трейси Кэмп , П. Кристофом Чампом, Шандором Морисом и Джеффри М. Варгасоном для полногеномного картирования Z-ДНК (с Хо в качестве главного исследователя). [11]
С момента открытия и кристаллизации Z-ДНК в 1979 году эта конфигурация оставила ученых в недоумении относительно пути и механизма перехода от конфигурации B-ДНК к конфигурации Z-ДНК. [12] Конформационное изменение структуры B-ДНК к Z-ДНК было неизвестно на атомном уровне, но в 2010 году компьютерное моделирование, проведенное Ли и др., позволило вычислительно определить, что пошаговое распространение перехода B-в-Z обеспечит более низкий энергетический барьер , чем ранее предполагаемый согласованный механизм. [13] Поскольку это было вычислительно доказано, путь все еще необходимо было бы экспериментально проверить в лаборатории для дальнейшего подтверждения и обоснованности, в чем Ли и др. специально заявляют в своей журнальной статье: «Текущий [вычислительный] результат может быть проверен с помощью экспериментов по FRET с одной молекулой (smFRET) в будущем». [13] В 2018 году путь от B-ДНК к Z-ДНК был экспериментально доказан с использованием анализов smFRET. [14] Это было выполнено путем измерения значений интенсивности между донорными и акцепторными флуоресцентными красителями, также известными как флуорофоры , по отношению друг к другу, когда они обмениваются электронами, будучи помеченными на молекуле ДНК. [15] [16] Расстояния между флуорофорами можно было использовать для количественного расчета изменений в близости красителей и конформационных изменений в ДНК. Высокоаффинный связывающий белок Z-ДНК , hZαADAR1, [17] использовался в различных концентрациях, чтобы вызвать трансформацию из B-ДНК в Z-ДНК. [14] Анализы smFRET выявили переходное состояние B*, которое образовалось, когда связывание hZαADAR1 накопилось на структуре B-ДНК и стабилизировало ее. [14] Этот шаг выполняется для того, чтобы избежать высокой энергии соединения, при которой структура B-ДНК может претерпеть конформационное изменение в структуру Z-ДНК без значительного, разрушительного изменения энергии. Этот результат совпадает с вычислительными результатами Ли и др., доказывающими, что механизм является ступенчатым, и его цель состоит в том, чтобы обеспечить более низкий энергетический барьер для конформационного изменения от конфигурации B-ДНК к конфигурации Z-ДНК. [13] Вопреки предыдущему представлению, связывающие белки на самом деле не стабилизируют конформацию Z-ДНК после ее формирования, но вместо этого они фактически способствуют образованию Z-ДНК непосредственно из конформации B*, которая формируется за счет связывания структуры B-ДНК высокоаффинными белками. [14]
Биологическая роль Z-ДНК в регуляции ответов интерферона I типа была подтверждена в исследованиях трех хорошо охарактеризованных редких менделевских заболеваний: симметричный дисхроматоз (OMIM: 127400), синдром Айкарди-Гутьера (OMIM: 615010) и двусторонний стриарный некроз/дистония. Семьи с гаплоидным транскриптомом ADAR позволили картировать варианты Zα непосредственно с болезнью, показав, что генетическая информация кодируется в ДНК как формой, так и последовательностью. [18] Роль в регуляции ответов интерферона I типа при раке также подтверждается выводами о том, что 40% группы опухолей зависели от фермента ADAR для выживания. [19]
В предыдущих исследованиях Z-ДНК была связана как с болезнью Альцгеймера, так и с системной красной волчанкой . Чтобы продемонстрировать это, было проведено исследование ДНК, обнаруженной в гиппокампе мозга, который был нормальным, умеренно пораженным болезнью Альцгеймера и тяжело пораженным болезнью Альцгеймера. С помощью кругового дихроизма это исследование показало наличие Z-ДНК в ДНК тех, кто был тяжело поражен. [20] В этом исследовании также было обнаружено, что основные части умеренно пораженной ДНК находились в промежуточной конформации BZ. Это важно, поскольку из этих результатов был сделан вывод, что переход от B-ДНК к Z-ДНК зависит от прогрессирования болезни Альцгеймера. [20] Кроме того, Z-ДНК связана с системной красной волчанкой (СКВ) через наличие естественных антител. Значительное количество антител против Z-ДНК было обнаружено у пациентов с СКВ и не присутствовало при других ревматических заболеваниях. [21] Существует два типа этих антител. С помощью радиоиммуноанализа было обнаружено, что один из них взаимодействует с основаниями, экспонированными на поверхности Z-ДНК и денатурированной ДНК, в то время как другой взаимодействует исключительно с зигзагообразным остовом только Z-ДНК. Подобно тому, как это обнаружено при болезни Альцгеймера, антитела различаются в зависимости от стадии заболевания, с максимальными антителами на самых активных стадиях СКВ.
Обычно считается, что Z-ДНК обеспечивает снятие торсионной деформации во время транскрипции , и это связано с отрицательной суперспирализацией . [5] [22] Однако, в то время как суперспирализация связана как с транскрипцией, так и с репликацией ДНК, образование Z-ДНК в первую очередь связано со скоростью транскрипции . [23]
Исследование человеческой хромосомы 22 показало корреляцию между областями формирования Z-ДНК и областями промотора ядерного фактора I. Это говорит о том, что транскрипция в некоторых человеческих генах может регулироваться образованием Z-ДНК и активацией ядерного фактора I. [11]
Было показано, что последовательности Z-ДНК выше промоторных областей стимулируют транскрипцию. Наибольшее увеличение активности наблюдается, когда последовательность Z-ДНК размещается на три спиральных витка после промоторной последовательности . Кроме того, при использовании техники сшивания микрококковой нуклеазой [24] маловероятно, что Z-ДНК образует нуклеосомы , которые часто располагаются до и/или после последовательности, образующей Z-ДНК. Из-за этого свойства предполагается, что Z-ДНК кодирует границу в позиционировании нуклеосом. Поскольку размещение нуклеосом влияет на связывание факторов транскрипции , считается, что Z-ДНК регулирует скорость транскрипции. [24]
Разработанная за путем РНК-полимеразы через отрицательную суперспирализацию, Z-ДНК, образованная посредством активной транскрипции, как было показано, увеличивает генетическую нестабильность, создавая склонность к мутагенезу вблизи промоторов. [25] Исследование Escherichia coli показало, что делеции генов спонтанно происходят в областях плазмиды, содержащих последовательности, образующие Z-ДНК. [26] Было обнаружено, что в клетках млекопитающих наличие таких последовательностей приводит к крупным делециям геномных фрагментов из-за двухцепочечных разрывов хромосом . Обе эти генетические модификации были связаны с транслокациями генов , обнаруженными при таких видах рака, как лейкемия и лимфома , поскольку области разрывов в опухолевых клетках были нанесены вокруг последовательностей, образующих Z-ДНК. [25] Однако более мелкие делеции в бактериальных плазмидах были связаны с проскальзыванием репликации , в то время как более крупные делеции, связанные с клетками млекопитающих, вызваны негомологичным восстановлением соединения концов, которое, как известно, подвержено ошибкам. [25] [26]
Токсическое действие бромистого этидия (EtBr) на трипаносомы обусловлено сдвигом их кинетопластидной ДНК в Z-форму. Сдвиг обусловлен интеркаляцией EtBr и последующим разрыхлением структуры ДНК, что приводит к раскручиванию ДНК, сдвигу в Z-форму и ингибированию репликации ДНК. [27]
Первый домен, связывающий Z-ДНК с высокой аффинностью, был обнаружен в ADAR1 с использованием подхода, разработанного Аланом Гербертом. [28] [29] Кристаллографические и ЯМР- исследования подтвердили биохимические выводы о том, что этот домен связывает Z-ДНК неспецифическим для последовательности образом. [30] [31] [32] Связанные домены были идентифицированы в ряде других белков посредством гомологии последовательностей . [29] Идентификация домена Zα предоставила инструмент для других кристаллографических исследований, которые привели к характеристике Z-РНК и соединения B–Z. Биологические исследования показали, что связывающий домен Z-ДНК ADAR1 может локализовать этот фермент, который изменяет последовательность вновь образованной РНК в местах активной транскрипции. [33] [34] Роль Zα, Z-ДНК и Z-РНК в защите генома от вторжения ретроэлементов Alu у людей превратилась в механизм регуляции врожденных иммунных ответов на dsRNA. Мутации в Zα являются причиной интерферонопатий человека, таких как синдром Менделя Айкарди-Гутьера. [35] [18] Кроме того, показано, что домены Zα локализуются в гранулах стресса из-за их врожденной способности связывать нуклеиновую кислоту. Более того, различные домены Zα по-разному связываются с Z-конформацией нуклеиновой кислоты, предоставляя важные пути для специфического нацеливания при разработке лекарств.
По мере более тщательного изучения Z-ДНК было обнаружено, что структура Z-ДНК может связываться с белками, связывающими Z-ДНК, посредством сил Ван-дер-Ваальса и водородных связей . [36] Одним из примеров белка, связывающего Z-ДНК, является белок вакцинии E3L, который является продуктом гена E3L и имитирует белок млекопитающих, связывающий Z-ДНК. [37] [38] Белок E3L не только имеет сродство к Z-ДНК, но также, как было обнаружено, играет роль в уровне тяжести вирулентности у мышей, вызванной вирусом вакцинии, типом поксвируса . Двумя критическими компонентами белка E3L, определяющими вирулентность, являются N-конец и C-конец . N-конец состоит из последовательности, похожей на последовательность домена Zα, также называемого доменом аденозиндезаминазы z-альфа , в то время как C-конец состоит из двухцепочечного РНК-связывающего мотива. [37] Благодаря исследованиям, проведенным Кимом, Й. и др. в Массачусетском технологическом институте, было показано, что замена N-конца белка E3L на последовательность домена Zα, содержащую 14 остатков связывания Z-ДНК, подобных E3L, не оказала практически никакого влияния на патогенность вируса у мышей. [37] Напротив, Ким, Й. и др. также обнаружили, что удаление всех 83 остатков N-конца E3L привело к снижению вирулентности. Это подтверждает их утверждение о том, что N-конец, содержащий остатки связывания Z-ДНК, необходим для вирулентности. [37] В целом, эти результаты показывают, что схожие остатки связывания Z-ДНК в пределах N-конца белка E3L и домена Zα являются наиболее важными структурными факторами, определяющими вирулентность, вызванную вирусом вакцинии, в то время как аминокислотные остатки, не участвующие в связывании Z-ДНК, оказывают незначительное или не оказывают никакого эффекта. Будущее значение этих результатов включает снижение связывания Z-ДНК E3L в вакцинах, содержащих вирус вакцинии, так что негативные реакции на вирус могут быть сведены к минимуму у людей. [37]
Кроме того, Александр Рич и Джин-А Квон обнаружили, что E3L действует как трансактиватор для человеческих генов IL-6, NF-AT и p53. Их результаты показывают, что клетки HeLa , содержащие E3L, имели повышенную экспрессию человеческих генов IL-6, NF-AT и p53, а точечные мутации или делеции определенных остатков аминокислот, связывающих Z-ДНК, снижали эту экспрессию. [36] В частности, было обнаружено, что мутации в Tyr 48 и Pro 63 снижают трансактивацию ранее упомянутых генов в результате потери водородных связей и лондоновских дисперсионных сил между E3L и Z-ДНК. [36] В целом, эти результаты показывают, что уменьшение связей и взаимодействий между Z-ДНК и связывающими белками Z-ДНК снижает как вирулентность, так и экспрессию генов, тем самым показывая важность наличия связей между Z-ДНК и связывающим белком E3L.