В энзимологии аланинрацемаза ( EC 5.1.1.1 ) — это фермент , катализирующий химическую реакцию
Следовательно, этот фермент имеет один субстрат , L-аланин , и один продукт , D-аланин .
Этот фермент принадлежит к семейству изомераз , в частности, к рацемазам и эпимеразам, действующим на аминокислоты и их производные. Систематическое название этого класса ферментов — аланинрацемаза . Этот фермент также называется L-аланинрацемаза . Этот фермент участвует в метаболизме аланина и аспартата , а также в метаболизме D- аланина . Он использует один кофактор — пиридоксальфосфат . Известно, что по крайней мере два соединения, 3-фтор-D-аланин и D-циклосерин, ингибируют этот фермент .
D-аланин, вырабатываемый аланинрацемазой, используется для биосинтеза пептидогликана. Пептидогликан содержится в клеточных стенках всех бактерий, включая многие из тех, которые вредны для человека. Этот фермент отсутствует у высших эукариот, но встречается повсеместно у прокариот, что делает аланинрацемазу прекрасной мишенью для разработки антимикробных препаратов. [1] Аланинрацемазу можно обнаружить у некоторых беспозвоночных. [2]
Бактерии могут иметь один (ген alr) или два гена аланинрацемазы. Бактериальные виды с двумя генами аланинрацемазы имеют один, который постоянно экспрессируется, и один, который индуцируется, что затрудняет нацеливание обоих генов для исследований лекарственных препаратов. Однако исследования нокаутов показали, что без экспрессии гена alr бактериям для выживания потребуется внешний источник D-аланина. Таким образом, ген alr является возможной целью для антимикробных препаратов. [1]
Аланиновая рацемаза является единственным известным белком, по состоянию на 2002 год, содержащим левую α-спираль из 5 аминокислот, самую длинную левую α-спираль, обнаруженную на тот момент. [3]
Чтобы катализировать взаимопревращение D- и L-аланина, аланиновая рацемаза должна располагать остатки, способные обмениваться протонами, по обе стороны от альфа-углерода аланина. Структурные исследования комплексов фермент-ингибитор предполагают, что этими остатками являются тирозин 265 и лизин 39. Альфа-протон L-энантиомера ориентирован к Tyr265, а альфа-протон D-энантиомера ориентирован к Lys39 (рисунок 1).
Расстояние между остатками фермента и энантиомерами составляет 3,5 Å и 3,6 Å соответственно. [4] Структурные исследования комплексов фермента с синтетическим аналогом L-аланина, ингибитором прочного связывания [5] и пропионатом [6] дополнительно подтверждают, что Tyr265 и Lys39 являются каталитическими основаниями для реакции. [5] [7]
Комплексы PLP-L-Ala и PLP-D-Ala почти накладываются друг на друга. [4] Области, которые не перекрываются, — это плечи, соединяющие пиридиновое кольцо PLP и альфа-углерод аланина. Взаимодействие между атомами кислорода фосфата и азота пиридина с 5'фосфопиридоксильной областью PLP-Ala, вероятно, создает прочную связь с ферментом. [4]
Структура аланиновой рацемазы из Bacillus stearothermophilus (Geobacillus stearothermophilus) была определена методом рентгеновской кристаллографии с разрешением 1,9 А. [7] Мономер аланиновой рацемазы состоит из двух доменов, восьмицепочечной альфа/бета-бочонка на N-конце и С-концевого домена, в основном состоящего из бета-цепи. Модель двухдоменной структуры показана на рисунке 2. N-концевой домен также обнаружен в семействе белков PROSC (пролинсинтетаза, ко -транскрибируемый бактериальный гомолог), которые, как известно, не обладают активностью аланиновой рацемазы. Кофактор пиридоксаль-5'-фосфата (PLP) находится внутри и выше устья альфа/бета-бочонка и ковалентно связан через альдиминовую связь с остатком лизина , который находится на С-конце первой бета-цепи альфа/бета-бочонка.
Механизмы реакции трудно полностью доказать экспериментально. Традиционный механизм, приписываемый реакции аланиновой рацемазы, представляет собой двухосновной механизм с промежуточным карбанионом, стабилизированным PLP. PLP используется в качестве поглотителя электронов, стабилизирующего отрицательный заряд, возникающий в результате депротонирования альфа-углерода. Двухосновный механизм благоприятствует специфичности реакции по сравнению с одноосновным механизмом. Второй каталитический остаток заранее расположен для быстрой отдачи протона после образования промежуточного карбаниона и, таким образом, снижает вероятность возникновения альтернативных реакций. Существуют два потенциальных конфликта с этим традиционным механизмом, как определили Ватанабе и др. Во-первых, Arg219 образует водородную связь с пиридиновым азотом PLP. [7] Группа аргинина имеет pKa около 12,6 и, следовательно, вряд ли протонирует пиридин. Обычно в реакциях PLP остаток кислой аминокислоты, такой как группа карбоновой кислоты, с pKa около 5, протонирует пиридиновое кольцо. [8] Протонирование пиридинового азота позволяет азоту принимать дополнительный отрицательный заряд. Поэтому из-за Arg219 промежуточный карбанион, стабилизированный PLP, с меньшей вероятностью будет образовываться. Другой выявленной проблемой была необходимость в другом основном остатке для возврата Lys39 и Tyr265 обратно в их протонированные и непротонированные формы для L-аланина и наоборот для D-аланина. Ватанабе и др. не обнаружили аминокислотных остатков или молекул воды, кроме карбоксилатной группы PLP-Ala, которые были бы достаточно близко (в пределах 4,5 А) для протонирования или депротонирования Lys или Tyr. Это показано на рисунке 3. [4]
На основе кристаллических структур N-(5'-фосфопиридоксила) L-аланина (PKP-L-Ala (и N-(5'-фосфопиридоксила) D-аланина (PLP-D-Ala)
Ватанабе и др. предложили альтернативный механизм в 2002 году, как показано на рисунке 4. В этом механизме атомы кислорода карбоксилата PLP-Ala напрямую участвуют в катализе, опосредуя перенос протонов между Lys39 и Tyr265. Структура кристаллизации определила, что кислород карбоксилата PLP-L-Ala к OH Tyr265 был всего 3,6A, а кислород карбоксилата PLP-L-Ala к азоту Lys39 был всего 3,5A. Следовательно, оба были достаточно близки, чтобы вызвать реакцию.
Этот механизм поддерживается мутациями Arg219. Мутации, изменяющие Arg219 на карбоксилат, приводят к обнаружению хиноидного промежуточного продукта, тогда как с аргинином ничего не обнаружено. [9] Аргининовый промежуточный продукт имеет гораздо больше свободной энергии, он более нестабилен, чем мутанты кислотных остатков. [8] Дестабилизация промежуточного продукта повышает специфичность реакции. [9] [10]
