stringtranslate.com

Анализ кометы

Скриншот приложения CaspLab Comet Assay

Анализ гель-электрофореза отдельных клеток ( SCGE , также известный как кометный анализ ) — это несложный и чувствительный метод обнаружения повреждений ДНК на уровне отдельной эукариотической клетки . Впервые он был разработан Эстлингом и Йоханссоном в 1984 году, а затем модифицирован Сингхом и др. в 1988 году. [1] С тех пор он стал популярным в качестве стандартного метода оценки повреждений/восстановления ДНК, биомониторинга и тестирования генотоксичности. Он включает инкапсуляцию клеток в суспензию агарозы с низкой температурой плавления, лизис клеток в нейтральных или щелочных (pH>13) условиях и электрофорез суспендированных лизированных клеток. Термин «комета» относится к схеме миграции ДНК через электрофорезный гель, которая часто напоминает комету. [2] [3]

Анализ комет (электрофорез в геле отдельных клеток) — это простой метод измерения разрывов нитей дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) в эукариотических клетках. Клетки, помещенные в агарозу на предметном стекле микроскопа, лизируются детергентом и высокой солью для образования нуклеоидов, содержащих сверхспиральные петли ДНК, связанные с ядерной матрицей. Электрофорез при высоком pH приводит к образованию структур, напоминающих кометы, наблюдаемых с помощью флуоресцентной микроскопии; интенсивность хвоста кометы относительно головы отражает количество разрывов ДНК. Вероятной основой этого является то, что петли, содержащие разрыв, теряют свою сверхспирализацию и становятся свободными для расширения в направлении анода. Затем следует визуальный анализ с окрашиванием ДНК и расчетом флуоресценции для определения степени повреждения ДНК. Это можно выполнить вручную или автоматически с помощью программного обеспечения для визуализации. [4] [5]

Процедура

Инкапсуляция

Образец клеток, полученный либо из культуры клеток in vitro , либо из испытуемого in vivo , диспергируется в отдельные клетки и суспендируется в расплавленной агарозе с низкой температурой плавления при 37 °C. Эта моносуспензия отливается на предметное стекло микроскопа . Покровное стекло удерживается под углом, и моносуспензия наносится на точку контакта между покровным стеклом и предметным стеклом. Когда покровное стекло опускается на предметное стекло, расплавленная агароза растекается, образуя тонкий слой. Агароза застывает при 4 °C, и покровное стекло удаляется.

Агароза образует матрицу из углеводных волокон, которые инкапсулируют клетки, закрепляя их на месте. Агароза считается осмотически нейтральной, поэтому растворы могут проникать в гель и воздействовать на клетки без смещения положения клеток.

В исследовании in vitro клетки подвергаются воздействию тестового агента – обычно ультрафиолетового света , ионизирующего излучения или генотоксичного химиката – для того, чтобы вызвать повреждение ДНК в инкапсулированных клетках. Для калибровки обычно используется перекись водорода , чтобы обеспечить стандартизированный уровень повреждения ДНК.

Лизис

Затем слайды погружают в раствор, который вызывает лизис клеток . Раствор для лизиса, часто используемый в кометном анализе, состоит из высококонцентрированной водной соли (часто можно использовать обычную поваренную соль ) и детергента (например, Тритон X-100 или саркозинат ). pH раствора для лизиса можно регулировать (обычно между нейтральным и щелочным pH) в зависимости от типа повреждения, которое исследует исследователь.

Водный раствор соли разрушает белки и их связи внутри клетки, а также нарушает содержание РНК в клетке. Детергент растворяет клеточные мембраны . Под действием лизирующего раствора клетки разрушаются. Все белки, РНК, мембраны и цитоплазматические и нуклеоплазматические компоненты разрушаются и диффундируют в агарозную матрицу. Остается только ДНК клетки, которая распутывается, заполняя полость в агарозе, которую ранее заполняла вся клетка. Эта структура называется нуклеоидом (общий термин для структуры, в которой сконцентрирована ДНК).

Электрофорез

После лизиса клеток (обычно 1–2 часа при 4 °C) слайды промывают в дистиллированной воде для удаления всех солей и погружают во второй раствор – раствор для электрофореза . Опять же, этот раствор может иметь pH, отрегулированный в зависимости от типа исследуемого повреждения.

Слайды оставляют на ~20 минут в растворе для электрофореза перед приложением электрического поля . В щелочных условиях двойная спираль ДНК денатурируется , и нуклеоид становится одноцепочечным.

Прикладывается электрическое поле (обычно 1 В / см ) на ~20 минут. Затем слайды нейтрализуются до pH 7, окрашиваются ДНК-специфическим флуоресцентным красителем и анализируются с помощью микроскопа с прикрепленным ПЗС ( прибор с зарядовой связью – по сути, цифровая камера ), который подключен к компьютеру с программным обеспечением для анализа изображений .

Фон

Концепция, лежащая в основе анализа SCGE, заключается в том, что неповрежденная ДНК сохраняет высокоорганизованную связь с белками матрицы в ядре. При повреждении эта организация нарушается. Отдельные нити ДНК теряют свою компактную структуру и расслабляются, расширяясь из полости в агарозу. При приложении электрического поля ДНК, имеющая общий отрицательный заряд, притягивается к положительно заряженному аноду. Неповрежденные нити ДНК слишком велики и не покидают полость, тогда как чем меньше фрагменты, тем дальше они могут свободно перемещаться за данный период времени. Таким образом, количество ДНК, покидающей полость, является мерой количества повреждений ДНК в клетке.

Анализ изображения измеряет общую интенсивность флуоресценции для всего нуклеоида и флуоресценцию мигрировавшей ДНК и сравнивает два сигнала. Чем сильнее сигнал от мигрировавшей ДНК, тем больше повреждений. Общая структура напоминает комету ( отсюда и «кометный анализ») с круглой головкой, соответствующей неповрежденной ДНК, которая остается в полости, и хвостом поврежденной ДНК. Чем ярче и длиннее хвост, тем выше уровень повреждений.

Анализ комет является универсальным методом обнаружения повреждений и с корректировками протокола может использоваться для количественной оценки наличия широкого спектра повреждений, изменяющих ДНК (повреждений). Обычно обнаруживаемые повреждения представляют собой одноцепочечные разрывы и двухцепочечные разрывы. Иногда утверждается [6] [7] , что для обнаружения одноцепочечных разрывов необходимы щелочные условия и полная денатурация ДНК. Однако это не так, как одноцепочечные, так и двухцепочечные разрывы также обнаруживаются в нейтральных условиях. [8] [9] [10] [11] Однако в щелочных условиях обнаруживаются дополнительные структуры ДНК как повреждения ДНК: сайты AP (сайты без оснований, в которых отсутствует либо пиримидиновый , либо пуриновый нуклеотид ) и сайты, где происходит эксцизионная репарация . [12] [13]

Анализ комет является чрезвычайно чувствительным анализом повреждения ДНК. С этой чувствительностью нужно обращаться осторожно, поскольку она также уязвима к физическим изменениям, которые могут повлиять на воспроизводимость результатов. По сути, следует избегать всего, что может вызвать повреждение или денатурацию ДНК, за исключением исследуемого фактора(ов). [14] Наиболее распространенной формой анализа является щелочная версия, хотя пока еще нет окончательного протокола щелочного анализа. Благодаря простой и недорогой настройке его можно использовать в условиях, когда более сложные анализы недоступны.

Приложения

К ним относятся тестирование генотоксичности, биомониторинг человека и молекулярная эпидемиология, экогенотоксикология, а также фундаментальные исследования в области повреждения и восстановления ДНК. [15] Например, Суэйн и Рао, используя анализ комет [16], сообщили о заметном увеличении нескольких типов повреждений ДНК в нейронах мозга крыс и астроцитах во время старения , включая одноцепочечные разрывы, двухцепочечные разрывы и модифицированные основания (8-OHdG и урацил).

Фрагментация ДНК сперматозоидов

Анализ комет может определить степень фрагментации ДНК в сперматозоидах. Степень фрагментации ДНК была связана с результатами экстракорпорального оплодотворения . [17] [18]

Комета была модифицирована для использования со сперматозоидами в качестве инструмента для диагностики мужского бесплодия [19] [20] [21]

Чтобы разрушить эти прочно связанные протаминовые белки и использовать комету для спермы, требуются дополнительные этапы в протоколе деконденсации. [20]

Ссылки

  1. ^ Сингх, Нарендра П.; Маккой, Майкл Т.; Тайс, Рэймонд Р.; Шнайдер, Эдвард Л. (1988-03-01). «Простая методика количественной оценки низких уровней повреждения ДНК в отдельных клетках». Experimental Cell Research . 175 (1): 184–191. doi :10.1016/0014-4827(88)90265-0. ISSN  0014-4827. PMID  3345800.
  2. ^ Tice, RR (2000). «Анализ геля/кометы отдельных клеток: руководство по in vitro и in vivo генетическому токсикологическому тестированию». Экологический и молекулярный мутагенез . 35 (3): 206–21. Bibcode : 2000EnvMM..35..206T. doi : 10.1002/(SICI)1098-2280(2000)35:3<206::AID-EM8>3.0.CO;2-J. PMID  10737956.
  3. ^ Nandhakumar, S; Parasuraman, S; Shanmugam, MM; Rao, KR; Chand, P; Bhat, BV (2011). «Оценка повреждения ДНК с помощью электрофореза в геле отдельных клеток (кометный анализ)». J Pharmacol Pharmacother . 2 (2): 107–11. doi : 10.4103/0976-500X.81903 . PMC 3127337. PMID  21772771 . 
  4. ^ Коллинз, AR (март 2004 г.). «Кометный анализ повреждений и восстановления ДНК: принципы, применение и ограничения». Mol. Biotechnol . 26 (3): 249–61. doi :10.1385/MB:26:3:249. PMID  15004294. S2CID  34355649.
  5. ^ Nandhakumar, S; Parasuraman, S; Shanmugam, MM; Rao, KR; Chand, P; Bhat, BV (апрель 2011 г.). «Оценка повреждения ДНК с помощью электрофореза в геле отдельных клеток (кометный анализ)». J Pharmacol Pharmacother . 2 (2): 107–11. doi : 10.4103/0976-500X.81903 . PMC 3127337. PMID  21772771. 
  6. ^ Pu, Xinzhu; Wang, Zemin; Klaunig, James E. (2015-08-06). «Анализ щелочных комет для оценки повреждения ДНК в отдельных клетках». Current Protocols in Toxicology . 65 : 3.12.1–11. doi :10.1002/0471140856.tx0312s65. ISBN 978-0471140856. ISSN  1934-9262. PMID  26250399. S2CID  6105193.
  7. ^ Мёллер, Питер (апрель 2006 г.). «Анализ щелочных комет: на пути к валидации в биомониторинге воздействий, повреждающих ДНК». Базовая и клиническая фармакология и токсикология . 98 (4): 336–345. doi : 10.1111/j.1742-7843.2006.pto_167.x . ISSN  1742-7835. PMID  16623855.
  8. ^ Беляев, Игорь Ю; Эрикссон, Стефан; Нигрен, Йонас; Торудд, Джеспер; Хармс-Рингдал, Матс (5 августа 1999 г.). «Влияние бромида этидия на организацию петель ДНК в лимфоцитах человека, измеренное с помощью зависимости аномальной вязкости от времени и гель-электрофореза отдельных клеток». Biochimica et Biophysical Acta (BBA) – Общие предметы . 1428 (2–3): 348–356. дои : 10.1016/S0304-4165(99)00076-8. ISSN  0304-4165. ПМИД  10434054.
  9. ^ Олив, ПЛ; Банат, ДЖП; Дюран, Р.Э. (апрель 1990 г.). «Гетерогенность в радиационно-индуцированных повреждениях ДНК и репарации в опухолевых и нормальных клетках, измеренная с помощью анализа «кометы». Radiation Research . 122 (1): 86–94. Bibcode : 1990RadR..122...86O. doi : 10.2307/3577587. ISSN  0033-7587. JSTOR  3577587. PMID  2320728.
  10. ^ Powell, S.; McMillan, TJ (1990-10-01). «Повреждение и восстановление ДНК после лечения ионизирующим излучением». Радиотерапия и онкология . 19 (2): 95–108. doi :10.1016/0167-8140(90)90123-E. ISSN  0167-8140. PMID  2255771.
  11. ^ Воеводзка, Мария; Бурачевска, Ивона; Крушевски, Марцин (2002-06-27). «Модифицированный нейтральный кометный анализ: устранение лизиса при высокой температуре и валидация анализа с помощью антитела к одноцепочечной ДНК». Mutation Research . 518 (1): 9–20. Bibcode :2002MRGTE.518....9W. doi :10.1016/s1383-5718(02)00070-0. ISSN  0027-5107. PMID  12063063.
  12. ^ Коллинз, Эндрю Р. (1997-04-29). «Кометный анализ: что он действительно может нам рассказать?». Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis . 375 (2): 183–193. Bibcode : 1997MRFMM.375..183C. doi : 10.1016/S0027-5107(97)00013-4. ISSN  0027-5107. PMID  9202728.
  13. ^ Гедик, CM; Эвен, SW; Коллинз, AR (сентябрь 1992 г.). «Гель-электрофорез отдельных клеток, применяемый для анализа повреждений УФ-С и их восстановления в клетках человека». Международный журнал радиационной биологии . 62 (3): 313–320. doi :10.1080/09553009214552161. ISSN  0955-3002. PMID  1356133.
  14. ^ Теоретические и практические ограничения анализа обсуждаются, например, в работах Клауда и др. (1996) и Коллинза и др. (1997).
  15. ^ https://www2.le.ac.uk/departments/csmm/.../SCG%20Electrophoresis.pdf [ постоянная мертвая ссылка ]
  16. ^ Свейн, У; Субба Рао, К (август 2011 г.). «Изучение повреждений ДНК с помощью кометного анализа и активности репарации эксцизионных оснований в нейронах мозга крыс и астроцитах во время старения». Mech Ageing Dev. 132 (8–9): 374–81. doi:10.1016/j.mad.2011.04.012. PMID 21600238. S2CID 22466782
  17. ^ Simon L, Brunborg G, Stevenson M, Lutton D, McManus J, Lewis SE (май 2010 г.). «Клиническое значение повреждения ДНК сперматозоидов в результатах вспомогательной репродукции». Hum Reprod . 25 (7): 1594–1608. doi : 10.1093/humrep/deq103 . PMID  20447937.
  18. ^ Награджаппа; Гангули, Анутош; Госвами, Уша (2006). «Повреждение ДНК в клетках мужских гонад зеленой мидии (Perna viridis) при воздействии табачных изделий». Экотоксикология . 15 (4): 365–369. Bibcode : 2006Ecotx..15..365N. doi : 10.1007/s10646-006-0077-1. PMID  16673160. S2CID  13956778.
  19. ^ Хьюз CM, Льюис SEM, Маккелви-Мартин V, Томпсон W. Воспроизводимость измерений ДНК спермы человека с использованием анализа электрофореза в геле отдельных клеток. Mutation Research 1997 374:261-268.
  20. ^ ab Donnelly, ET; McClure, N; Lewis, SEM (1999). «Влияние добавления аскорбата и @-токоферола in vitro на целостность ДНК и вызванное перекисью водорода повреждение ДНК в сперматозоидах человека». Mutagenesis . 14 (5): 505–511. doi : 10.1093/mutage/14.5.505 . PMID  10473655.
  21. ^ Рибас-Майноу Хорди, Агустин Гарсиа-Пейро, Альба Фернандес-Энсинас, Мария Хосе Аменгуаль и Бенет Хорди, Двуцепочечные разрывы ДНК сперматозоидов, измеренные с помощью кометного анализа, связаны с необъяснимыми повторяющимися выкидышами у пар без женского фактора

Дальнейшее чтение