stringtranslate.com

Аспартаткарбамоилтрансфераза

Аспартаткарбамоилтрансфераза (также известная как аспартаттранскарбамоилаза или АТКаза ) катализирует первый этап в пути биосинтеза пиримидина ( EC 2.1.3.2). [1]

В E. coli фермент представляет собой многосубъединичный белковый комплекс , состоящий из 12 субъединиц (всего 300 кДа). [2] Состав субъединиц - C 6 R 6 , образующий 2 тримера каталитических субъединиц (34 кДа) и 3 димера регуляторных субъединиц (17 кДа). Особое расположение каталитических и регуляторных субъединиц в этом ферменте обеспечивает комплексу сильное аллостерическое поведение по отношению к его субстратам. [3] Фермент является архетипическим примером аллостерической модуляции тонкого контроля метаболических ферментативных реакций.

ATCase не следует кинетике Михаэлиса-Ментен . Вместо этого она находится между своими низкоактивными, низкоаффинными "напряженными" состояниями и высокоактивными, высокоаффинными "расслабленными" состояниями. [4] Связывание субстрата с каталитическими субъединицами приводит к сдвигу равновесия в сторону состояния R, тогда как связывание CTP с регуляторными субъединицами приводит к сдвигу равновесия в сторону состояния T. Связывание ATP с регуляторными субъединицами приводит к сдвигу равновесия в сторону состояния R. [5]

Реакция

ATCase — это высокорегулируемый фермент, который катализирует первый обязательный шаг в биосинтезе пиримидина, конденсацию L-аспартата и карбамоилфосфата с образованием N-карбамоил-L-аспартата и неорганического фосфата . Катализ ATCase служит лимитирующим шагом в биосинтезе пиримидина, поскольку он изменяет его каталитическую скорость в ответ на клеточные уровни как пиримидинов , так и пуринов . Конечный продукт пиримидинового пути, CTP , снижает каталитическую скорость, тогда как ATP , конечный продукт параллельного пуринового пути, увеличивает каталитическую скорость.Реакция аспартаттранскарбамилазы.

Структура

Схематическая диаграмма структуры ATCase, изображающая пространственное расположение зеленых регуляторных (R) и синих каталитических (C) субъединиц. Перерисовано и изменено из Ke et al. , 1984. [6]

Последующее обсуждение структуры, каталитического центра и аллостерического сайта основано на прокариотической версии АТКазы, в частности, у E. coli .

Ранние исследования показали, что ATCase состоит из двух различных видов полипептидных цепей, которые играют разные роли. [7] Каталитические субъединицы катализируют карбамилирование аминогруппы аспартата , но не обладают регуляторными свойствами, в то время как регуляторные субъединицы не обладают каталитической активностью, но содержат регуляторные сайты для связывания эффекторов. Холофермент ATCase состоит из двух каталитических тримеров, которые находятся в контакте и удерживаются вместе тремя регуляторными димерами, поэтому нативная форма фермента содержит шесть цепей каждого типа с общей молекулярной массой 310 кДа .

Каждый из каталитических доменов состоит из двух структурных доменов, домена аспартата, который содержит большую часть остатков, ответственных за связывание аспартата , и домена карбамоилфосфата, который содержит большую часть остатков, связывающихся с карбамоилфосфатом . Каждый регуляторный домен также состоит из двух доменов, аллостерического домена, который имеет сайт связывания для нуклеотидных эффекторов , и домена цинка , состоящего из четырех остатков цистеина, сгруппированных в его С-концевой области. Эти остатки координируют атом цинка , который не участвует ни в каком каталитическом свойстве, но, как было показано, необходим для ассоциации регуляторных и каталитических субъединиц. [8]

Трехмерное расположение каталитических и регуляторных субъединиц включает несколько ионных и гидрофобных стабилизирующих контактов между аминокислотными остатками. [6] Каждая каталитическая цепь контактирует с тремя другими каталитическими цепями и двумя регуляторными цепями. Каждый регуляторный мономер контактирует с одной другой регуляторной цепью и двумя каталитическими цепями. В нелигандированном ферменте два каталитических тримера также контактируют.

Каталитический центр

Каталитический сайт ATCase расположен на границе двух соседних каталитических цепей в одном и том же тримере и включает боковые цепи аминокислот из обеих этих субъединиц. Понимание способа связывания субстратов с каталитическим центром ATCase впервые стало возможным благодаря связыванию бисубстратного аналога, N-(фосфоноацетил)-L-аспартата (PALA). [9] Это соединение является сильным ингибитором ATCase и имеет структуру, которая, как полагают, очень близка к структуре переходного состояния субстратов. [10] Кроме того, были получены кристаллические структуры ATCase, связанной с карбамоилфосфатом и сукцинатом. [11] Эти исследования, в дополнение к исследованиям с использованием направленного мутагенеза определенных аминокислот, выявили несколько остатков, которые имеют решающее значение для катализа, такие как Ser52, Thr53, Arg54, Thr55, Arg105, His134, Gln137, Arg167, Arg229, Glu231 и Ser80 и Lys84 из соседней каталитической цепи. Активный центр представляет собой сильно положительно заряженный карман. Одна из наиболее критических боковых цепей исходит от Arg54, который взаимодействует с терминальным кислородом и ангидридным кислородом карбамоилфосфата, стабилизируя отрицательный заряд уходящей фосфатной группы. Arg105, His134 и Thr55 помогают увеличить электрофильность карбонильного углерода, взаимодействуя с карбонильным кислородом. [7] В целом, повышение скорости АТКазы достигается за счет ориентации и стабилизации субстратов, промежуточных соединений и продуктов, а не за счет прямого участия аминокислотных остатков в каталитическом механизме.

Аллостерический сайт

Аллостерический сайт в аллостерическом домене R-цепей комплекса ATCase связывается с нуклеотидами ATP, CTP и/или UTP. В каждом регуляторном димере есть один сайт с высоким сродством к ATP и CTP и один с 10–20-кратно более низким сродством к этим нуклеотидам. [7] ATP связывается преимущественно с сайтами с высоким сродством и впоследствии активирует фермент, в то время как связывание UTP и CTP приводит к ингибированию активности. UTP может связываться с аллостерическим сайтом, но ингибирование ATCase посредством UTP возможно только в сочетании с CTP. При наличии CTP связывание UTP усиливается и преимущественно направляется на сайты с низким сродством. Наоборот, связывание UTP приводит к повышению сродства к CTP на сайтах с высоким сродством, и вместе они ингибируют активность фермента до 95%, в то время как связывание CTP само по себе ингибирует активность на 50–70%. [3] Сравнение кристаллических структур форм T и R ATCase показывает, что она увеличивается в размерах во время аллостерического перехода, и что каталитические субъединицы конденсируются во время этого процесса. Два каталитических тримера раздвигаются вдоль тройной оси на 12 Å, и они вращаются вокруг этой оси на 5° каждый, в конечном итоге приводя к переориентации регуляторных субъединиц вокруг их двойной оси на 15°. [12] Это изменение четвертичной структуры связано с изменениями во взаимодействиях между субъединицами и между доменами. Взаимодействие между субъединицами C1-C4 и R1 значительно изменяется во время этого преобразования. В частности, наблюдается большое перемещение аминокислотных остатков 230–254, известных под общим названием петля 240s. Эти остатки расположены в щели между доменами карбамоилфосфата и аспартата на интерфейсе C1-C4. Общим результатом этих структурных изменений является то, что два домена каждой каталитической цепи сближаются, обеспечивая лучший контакт с субстратами или их аналогами .

Во время этого структурного перехода некоторые взаимодействия между боковыми цепями теряются, а некоторые другие устанавливаются. Исследования подтвердили, что положение петли 240s напрямую влияет на связывание субстрата в соответствующем активном сайте. [13] Более ранние исследования с использованием направленного мутагенеза петли 240s показали, что взаимодействия между Asp271 и Tyr240, а также между Glu239 C1 и Tyr165 C4 стабилизируют T-состояние, в то время как взаимодействия между Glu239 C1 и Lys164 и Tyr165 C4 стабилизируют R-состояние. [14]

Расположенный близко к петле 240s и активному сайту, участок петли, охватывающий остатки 160–166, играет роль как во внутренней архитектуре фермента, так и в его регуляторных свойствах. [15] В частности, остаток Asp162 взаимодействует с Gln231 (известно, что он участвует в связывании аспартата) и связывает те же остатки как в состояниях T, так и в R. Мутант, у которого этот остаток был мутирован в аланин, показал огромное снижение удельной активности, двукратное снижение сродства к аспартату , потерю гомотропной кооперативности и снижение активации АТФ . Было высказано предположение, что изменение общей структуры, вызванное введением этого остатка, влияет на другие остатки в интерфейсах R1-C1, R1-C4 и C1-C4, которые участвуют в переходе четвертичной структуры . [16]

Сборка комплекса

Регуляторные и каталитические субъединицы существуют как слитые белковые гомологи, что дает веские доказательства того, что они будут взаимодействовать друг с другом. [17] Два каталитических тримера и два регуляторных димера собираются, образуя промежуточное соединение аспартаткарбамоилтрансферазы, состоящее из 6 каталитических субъединиц и 4 регуляторных субъединиц. [18]

Ссылки

  1. ^ Simmer JP, Kelly RE, Rinker AG, Zimmermann BH, Scully JL, Kim H, Evans DR (январь 1990 г.). «Дигидрооротаза млекопитающих: нуклеотидная последовательность, пептидные последовательности и эволюция домена дигидрооротазы многофункционального белка CAD». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 87 (1): 174–8. Bibcode : 1990PNAS...87..174S. doi : 10.1073 /pnas.87.1.174 . PMC  53223. PMID  1967494.
  2. ^ Macol CP, Tsuruta H, Stec B, Kantrowitz ER (май 2001 г.). «Прямое структурное доказательство согласованного аллостерического перехода в аспартаттранскарбамоилазе Escherichia coli». Nature Structural Biology . 8 (5): 423–6. doi :10.1038/87582. PMID  11323717. S2CID  35403933.
  3. ^ ab Helmstaedt K, Krappmann S, Braus GH (сентябрь 2001 г.). «Аллостерическая регуляция каталитической активности: аспартаттранскарбамоилаза Escherichia coli против хоризматмутазы дрожжей». Microbiology and Molecular Biology Reviews . 65 (3): 404–21, оглавление. doi :10.1128/MMBR.65.3.404-421.2001. PMC 99034 . PMID  11528003. 
  4. ^ Биохимия, Кэмпбелл и Фаррелл, Глава 7
  5. ^ Альбертс, Брюс. Молекулярная биология клетки . ISBN 978-1-315-73536-8. OCLC  1082214404.
  6. ^ ab Ke HM, Honzatko RB, Lipscomb WN (июль 1984). "Структура нелигированной аспартаткарбамоилтрансферазы Escherichia coli при разрешении 2,6 Å". Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 81 (13): 4037–40. doi : 10.1073/pnas.81.13.4037 . PMC 345363. PMID  6377306 . 
  7. ^ abc Lipscomb WN (1994). "Аспартаттранскарбамилаза из Escherichia coli: активность и регуляция". Advances in Enzymology and Related Areas of Molecular Biology . Advances in Enzymology – and Related Areas of Molecular Biology. Vol. 68. pp. 67–151. doi :10.1002/9780470123140.ch3. ISBN 9780470123140. PMID  8154326.
  8. ^ Kantrowitz ER, Lipscomb WN (август 1988). "Аспартаттранскарбамилаза Escherichia coli: связь между структурой и функцией". Science . 241 (4866): 669–74. Bibcode :1988Sci...241..669K. doi :10.1126/science.3041592. PMID  3041592.
  9. ^ Krause KL, Volz KW, Lipscomb WN (февраль 1987). "2.5 Структура аспартаткарбамоилтрансферазы в комплексе с бисубстратным аналогом N-(фосфонацетил)-L-аспартатом". Журнал молекулярной биологии . 193 (3): 527–53. doi :10.1016/0022-2836(87)90265-8. PMID  3586030.
  10. ^ Wang J, Stieglitz KA, Cardia JP, Kantrowitz ER (июнь 2005 г.). «Структурная основа для упорядоченного связывания субстрата и кооперативности в аспартаттранскарбамоилазе». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 102 (25): 8881–6. Bibcode : 2005PNAS..102.8881W. doi : 10.1073 /pnas.0503742102 . PMC 1157055. PMID  15951418. 
  11. ^ Gouaux JE, Lipscomb WN (июнь 1988 г.). «Трехмерная структура карбамоилфосфата и сукцината, связанных с аспартаткарбамоилтрансферазой». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 85 (12): 4205–8. Bibcode : 1988PNAS...85.4205G. doi : 10.1073/pnas.85.12.4205 . PMC 280395. PMID  3380787. 
  12. ^ Kantrowitz ER, Lipscomb WN (февраль 1990 г.). «Аспартаттранскарбамоилаза Escherichia coli: молекулярная основа для согласованного аллостерического перехода». Trends in Biochemical Sciences . 15 (2): 53–9. doi :10.1016/0968-0004(90)90176-C. PMID  2186515.
  13. ^ Fetler L, Vachette P, Hervé G, Ladjimi MM (декабрь 1995 г.). «В отличие от перехода четвертичной структуры, изменение третичной структуры петли 240s в аллостерической аспартаттранскарбамилазе требует насыщения активного центра субстратом для завершения». Биохимия . 34 (48): 15654–60. doi :10.1021/bi00048a008. PMID  7495794.
  14. ^ Middleton SA, Kantrowitz ER (август 1986 г.). «Важность петли в остатках 230–245 в аллостерических взаимодействиях аспартаткарбамоилтрансферазы Escherichia coli». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 83 (16): 5866–70. Bibcode : 1986PNAS...83.5866M. doi : 10.1073 /pnas.83.16.5866 . PMC 386397. PMID  3526342. 
  15. ^ Newton CJ, Stevens RC, Kantrowitz ER (март 1992). «Важность консервативного остатка, аспартата-162, для функции аспартаттранскарбамоилазы Escherichia coli». Биохимия . 31 (11): 3026–32. doi :10.1021/bi00126a026. PMID  1550826.
  16. ^ Fetler L, Tauc P, Baker DP, Macol CP, Kantrowitz ER, Vachette P (май 2002 г.). «Замена Asp-162 на Ala предотвращает кооперативный переход субстратами, одновременно усиливая эффект аллостерического активатора АТФ на аспартаттранскарбамоилазу E. coli». Protein Science . 11 (5): 1074–81. doi :10.1110/ps.4500102. PMC 2373563 . PMID  11967364. 
  17. ^ Marsh JA, Hernández H, Hall Z, Ahnert SE, Perica T, Robinson CV, Teichmann SA (апрель 2013 г.). «Белковые комплексы подвергаются эволюционному отбору для сборки через упорядоченные пути». Cell . 153 (2): 461–470. doi :10.1016/j.cell.2013.02.044. PMC 4009401 . PMID  23582331. 
  18. ^ Evans DR, Pastra-Landis SC, Lipscomb WN (апрель 1974 г.). «Промежуточный комплекс при диссоциации аспартаттранскарбамилазы». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 71 (4): 1351–5. Bibcode :1974PNAS...71.1351E. doi : 10.1073/pnas.71.4.1351 . PMC 388226 . PMID  4598300. 

Внешние ссылки