Многоклеточные организмы, в которых или на которых не живут микроорганизмы.
Безмикробные организмы — это многоклеточные организмы , в которых или на них не живут микроорганизмы . Такие организмы выращиваются с использованием различных методов для контроля их воздействия вирусных , бактериальных или паразитарных агентов. [1] Когда известная микробиота вводится в безмикробный организм, его обычно называют гнотобиотическим организмом , однако технически говоря, безмикробные организмы также являются гнотобиотическими, поскольку статус их микробного сообщества известен . [ 2] Из-за отсутствия микробиома многие безмикробные организмы демонстрируют дефицит здоровья, такой как дефекты иммунной системы и трудности с получением энергии. [3] [4] Обычно безмикробные организмы используются при изучении микробиома, где требуется тщательный контроль внешних загрязнителей. [5]
Генерация и выращивание
Безмикробные организмы создаются различными способами, но общепринятой практикой для многих из них является некая форма стерилизации , за которой следует изоляция от окружающей среды для предотвращения заражения .
Птица
Стерильная птица обычно проходит несколько стадий стерилизации еще на стадии яйца. Это может включать в себя мытье отбеливателем или раствором антибиотика для поверхностной стерилизации яйца. Затем яйца переносятся в стерильный инкубатор, где они выращиваются до вылупления. После вылупления им дают стерилизованную воду и гамма-облученный корм. Это предотвращает попадание чужеродных микробов в их кишечный тракт. Инкубаторы и отходы животных постоянно контролируются на предмет возможного заражения. Обычно при использовании в экспериментах животным в возрасте нескольких дней вводят известный микробиом. Заражение все еще отслеживается и контролируется после этого момента, но присутствие микробов ожидается. [6] [7] [8]
Мыши
Мыши проходят немного другой процесс из-за отсутствия стадии яйцеклетки. Чтобы создать безмикробную мышь, эмбрион создается с помощью экстракорпорального оплодотворения , а затем пересаживается безмикробной матери. Если этот метод недоступен, мышь может родиться с помощью кесарева сечения, но это сопряжено с более высоким риском заражения. Этот процесс использует небезмикробную мать, которую умерщвляют и стерилизуют до рождения детенышей. После кесарева сечения детеныши должны быть переведены в стерильный инкубатор с безмикробной матерью для кормления и роста. [9] [10] Эти методы требуются только для создания линии безмикробных мышей. После создания линии все потомство будет безмикробным, если только оно не заражено. Затем это потомство можно использовать для экспериментов. Обычно для экспериментов каждую мышь содержат отдельно в стерильном изоляторе, чтобы предотвратить перекрестное заражение между мышами. Мышам предоставляют стерилизованную пищу и воду для предотвращения заражения. Методы стерилизации могут различаться в зависимости от эксперимента из-за различных диет или лекарств, которым подвергаются мыши. Изоляторы и отходы постоянно контролируются на предмет возможного заражения для обеспечения полной стерильности. Как и в случае с птицей, известный микробиом может быть введен животным, но заражение все равно контролируется. [11] [12] [13]
Нематоды
Нематоды также могут быть выращены без микробов. Без микробов потомство нематоды C. elegans , которая используется в исследованиях, может быть получено путем разрыва взрослых червей для высвобождения яиц. Стандартный метод для этого заключается в том, чтобы ввести популяцию взрослых червей в раствор отбеливателя. Этот раствор отбеливателя разрывает взрослых червей, разрушая их, одновременно высвобождая и стерилизуя поверхность любых яиц. Стерилизованные яйца промывают и переносят на чашку с агаром, содержащим пищу для червей. C. elegans потребляет бактерии, поэтому перед тем, как яйца можно будет перенести на чашку, пищу необходимо убить либо нагреванием, либо облучением. Этот метод создания без микробов нематод имеет дополнительное преимущество в виде синхронизации возраста червей, так что все они будут одного возраста по мере роста. Обычно червей необходимо пересаживать на новую чашку, поскольку они потребляют всю пищу на текущей чашке, при этом каждая чашка также подвергается обработке нагреванием или облучением. Пластины можно защитить от внешнего загрязнения, накрыв их и изолировав от возможных источников загрязнения. [14]
Растения
Семена стерилизуются с помощью химикатов, таких как этанол или раствор антибиотика, чтобы получить растение без микробов. Затем семена выращиваются в воде или других средах до прорастания. После прорастания семена переносятся либо в стерильную почву, либо в почву с определенной микробиотой для использования в экспериментах. Семена также могут быть перенесены непосредственно в почву и прорастать. Если растения переносятся в стерильную почву, обычно существует два типа методов выращивания. Первый заключается в том, что все растение остается стерильным, а во втором — только корневая система. Метод выбирается на основе требований эксперимента. Растения выращиваются в изоляторах, которые часто проверяются на загрязнение вместе с почвой, в которой растут растения. [15] [16]
Фруктовые мушки
Плодовые мушки, в частности вид Drosophila , были одними из наиболее часто используемых модельных организмов . Вид Drosophila в основном использовался в области генетики . Существует два основных метода получения гнотобиотических или аксенических мух. Один из них заключается в сборе яиц и их дехорионизации. Хорион — это внешняя мембрана вокруг эмбриона. В асептических условиях яйца дважды промывают по 2,5 минуты каждое в 0,6% растворе гипохлорита натрия. Затем их помещают вместе с образцом в 90 мл отбеливателя. После этого их трижды промывают в стерильной воде. Дехорионизированные яйца затем помещают во флаконы со стерильной диетой. [17]
Второй метод заключается в использовании антибиотиков . Среда, такая как стандартная диета из дрожжей и кукурузной муки, дополняется стрептомицином или комбинацией антибиотиков. Концентрация антибиотика составляет 400 мкг/мл. После того, как диета из дрожжей и кукурузной муки остынет, на литр пищи добавляется 4 мл раствора, содержащего 10 г стрептомицина, растворенного в 100 мл этанола. Затем среда разливается по пробиркам, и свежесобранные яйца переносятся во пробирки. [18]
Влияние на здоровье организма
Из-за отсутствия здорового микробиома многие безмикробные организмы демонстрируют серьезные дефициты здоровья. Методы, используемые для получения безмикробных организмов, также могут иметь негативные побочные эффекты для организма. Снижение скорости вылупления наблюдалось в куриных яйцах, инкубированных с хлоридом ртути , в то время как обработка надуксусной кислотой не оказала значительного влияния на скорость вылупления. [8] У цыплят также наблюдались дефекты роста и здоровья тонкого кишечника. [6] Было показано, что у безмикробных мышей наблюдаются дефекты иммунной системы и потребления энергии из-за отсутствия здорового микробиома. [3] [4] Также имеются веские доказательства взаимодействия между микробиомом мыши и развитием и здоровьем ее мозга . [13] [19] [20] Безмикробные растения демонстрируют серьезные дефекты роста из-за отсутствия симбионтов, которые обеспечивают их необходимыми питательными веществами. [16] [21]
Использует
Микробиомные исследования
Безмикробные животные обычно используются для установления причинно-следственной связи в исследованиях микробиома. [22] [23] Это делается путем сравнения животных со стандартным комменсальным кишечным микробиомом с безмикробными или путем колонизации безмикробного животного интересующим организмом. Микробиота кишечника может различаться в разных исследовательских учреждениях, что может быть фактором, затрудняющим эксперименты, и быть причиной отсутствия воспроизводимости. [24] Было разработано несколько контрольных микробиомов, которые исправляют основные дефекты здоровья, обычно присутствующие у безмикробных животных, и могут выступать в качестве воспроизводимого контрольного сообщества. [25] [26] Безмикробные животные использовались для демонстрации причинно-следственной роли кишечного микробиома в различных условиях, таких как развитие нервной системы , [27] долголетие, [28] иммунотерапия рака, [29] и множество других контекстов, связанных со здоровьем. [30]
^ "Germ Free Mouse Facility". Мичиганский университет. Архивировано из оригинала 30 октября 2015 г.
^ Reyniers JA (1959). «Безмикробные позвоночные: современное состояние». Анналы Нью-Йоркской академии наук . 78 (1): 3. doi :10.1111/j.1749-6632.1959.tb53091.x. S2CID 84048961.
^ ab Boulangé CL, Neves AL, Chilloux J, Nicholson JK, Dumas ME (апрель 2016 г.). «Влияние микробиоты кишечника на воспаление, ожирение и метаболические заболевания». Genome Medicine . 8 (1): 42. doi : 10.1186/s13073-016-0303-2 . PMC 4839080 . PMID 27098727.
^ ab Round JL, Mazmanian SK (май 2009). «Микробиота кишечника формирует иммунные реакции кишечника во время здоровья и болезни». Nature Reviews. Иммунология . 9 (5): 313–23. doi :10.1038/nri2515. PMC 4095778. PMID 19343057 .
^ Armbrecht J (2 августа 2000 г.). «Of Probiotics and Possibilities». Кафедра бактериологии, Университет Висконсин-Мэдисон . Архивировано из оригинала 11 марта 2007 г.
^ ab Cheled-Shoval, SL; Gamage, NS Withana; Amit-Romach, E.; Forder, R.; Marshal, J.; Van Kessel, A.; Uni, Z. (2014-03-01). "Различия в динамике кишечного муцина между стерильными и традиционно выращенными цыплятами после добавления маннанолигосахарида". Poultry Science . 93 (3): 636–644. doi : 10.3382/ps.2013-03362 . ISSN 0032-5791. PMID 24604857.
^ Томас, Милтон; Вонгкуна, Супапит; Гимире, Судип; Кумар, Рошан; Энтони, Линто; Дорнер, Кинчель К.; Сингери, Аарон; Нельсон, Эрик; Войенго, Тофуко; Чанкхамхенгдеча, Суранг; Джанвилисри, Таван (24 апреля 2019 г.). «Динамика кишечной микрофлоры во время конвенционализации стерильной курицы». мСфера . 4 (2). doi : 10.1128/mSphere.00035-19. ISSN 2379-5042. ПМК 6437271 . ПМИД 30918057.
^ ab Harrison, GF (апрель 1969). «Производство цыплят без микробов: сравнение выводимости яиц, стерилизованных снаружи разными методами». Laboratory Animals . 3 (1): 51–59. doi : 10.1258/002367769781071871 . ISSN 0023-6772.
^ Biosciences, Taconic. «Что такое безмикробные мыши и как их получают?». www.taconic.com . Получено 29.11.2019 .
^ Арвидссон, Карина и Халлен, Анна и Бекхед, Фредрик. (2012). Создание и анализ мышей, свободных от микробов. 10.1002/9780470942390.mo120064.
^ Duerkop, Breck A.; Clements, Charmaine V.; Rollins, Darcy; Rodrigues, Jorge LM; Hooper, Lora V. (2012-10-23). «Композитный бактериофаг изменяет колонизацию кишечной комменсальной бактерией». Труды Национальной академии наук . 109 (43): 17621–17626. Bibcode : 2012PNAS..10917621D. doi : 10.1073/pnas.1206136109 . ISSN 0027-8424. PMC 3491505. PMID 23045666 .
^ ab Heijtz, Rochellys Diaz; Wang, Shugui; Anuar, Farhana; Qian, Yu; Björkholm, Britta; Samuelsson, Annika; Hibberd, Martin L.; Forssberg, Hans; Pettersson, Sven (2011-02-15). "Нормальная микробиота кишечника модулирует развитие мозга и поведение". Труды Национальной академии наук . 108 (7): 3047–3052. Bibcode : 2011PNAS..108.3047H. doi : 10.1073/pnas.1010529108 . ISSN 0027-8424. PMC 3041077. PMID 21282636 .
^ Стирнагл, Т. Поддержание C. elegans (11 февраля 2006 г.), WormBook , ред. Исследовательское сообщество C. elegans , WormBook, doi/10.1895/wormbook.1.101.1, http://www.wormbook.org.
^ Niu, Ben; Paulson, Joseph Nathaniel; Zheng, Xiaoqi; Kolter, Roberto (2017-03-21). «Упрощенное и репрезентативное бактериальное сообщество корней кукурузы». Труды Национальной академии наук . 114 (12): E2450–E2459. Bibcode : 2017PNAS..114E2450N. doi : 10.1073/pnas.1616148114 . ISSN 0027-8424. PMC 5373366. PMID 28275097 .
^ ab Strissel, Jerry Fred, "Безбактериальные соевые растения" (1970). Ретроспективные диссертации и тезисы . 4800. https://lib.dr.iastate.edu/rtd/4800
^ Койл, Мелинда Л.; Велос, Мадлен; Джадд, Алек М.; Вонг, Адам К.-Н.; Ньюэлл, Питер Д.; Дуглас, Анджела Э.; Частон, Джон М. (2016-07-30). «Выращивание плодовой мухи Drosophila melanogaster в аксенических и гнотобиотических условиях». Журнал визуализированных экспериментов (113): 54219. doi : 10.3791/54219. ISSN 1940-087X. PMC 5091700. PMID 27500374 .
^ Хейс, Хлоя; Лизе, Энн; Блоу, Фрэнсис; Уайт, Льюис; Дарби, Алистер; Льюис, Зенобия Дж. (2018-03-26). «Эффект устранения кишечной микробиоты у Drosophila melanogaster: практическое руководство по исследованиям хозяина и микробиоты». Экология и эволюция . 8 (8): 4150–4161. doi :10.1002/ece3.3991. ISSN 2045-7758. PMC 5916298. PMID 29721287 .
^ Park, AJ; Collins, J; Blennerhassett, PA; Ghia, JE; Verdu, EF; Bercik, P; Collins, SM (сентябрь 2013 г.). «Измененная функция толстой кишки и профиль микробиоты в мышиной модели хронической депрессии». Neurogastroenterology and Motility . 25 (9): 733–e575. doi :10.1111/nmo.12153. ISSN 1350-1925. PMC 3912902 . PMID 23773726.
^ Майер, Эмеран А.; Тиллиш, Кирстен; Гупта, Арпана (2015-03-02). «Ось кишечник/мозг и микробиота». Журнал клинических исследований . 125 (3): 926–938. doi :10.1172/JCI76304. ISSN 0021-9738. PMC 4362231. PMID 25689247 .
^ Кучера, Ульрих; Кханна, Раджниш (2016-12-01). "Гнотобиология растений: эпифитные микробы и устойчивое сельское хозяйство". Plant Signaling & Behavior . 11 (12): e1256529. doi :10.1080/15592324.2016.1256529. PMC 5225935. PMID 27830978 .
^ Жерар, Филипп (ноябрь 2017 г.). «Микробиом кишечника и ожирение. Как доказать причинно-следственную связь?». Annals of the American Thoracic Society . 14 (Supplement_5): S354–S356. doi :10.1513/AnnalsATS.201702-117AW. ISSN 2325-6621. PMID 29161082.
^ Фриц, Жоэль В.; Десаи, Махеш С.; Шах, Пранджул; Шнайдер, Йохен Г.; Вильмес, Пол (2013-05-03). «От мета-омики к причинности: экспериментальные модели для исследования микробиома человека». Микробиом . 1 (1): 14. doi : 10.1186/2049-2618-1-14 . ISSN 2049-2618. PMC 3971605. PMID 24450613 .
^ Рауш, Филипп; Бейсик, Марияна; Батра, Арвинд; Бишофф, Стефан К.; Блаут, Михаэль; Клавель, Томас; Глеснер, Иоахим; Гопалакришнан, Шрея; Грассл, Гунтрам А.; Гюнтер, Клаудия; Халлер, Дирк (август 2016 г.). «Анализ факторов, способствующих изменению фекальной микробиоты C57BL/6J в немецких вивариях». Международный журнал медицинской микробиологии . 306 (5): 343–355. doi : 10.1016/j.ijmm.2016.03.004 . hdl : 11858/00-001M-0000-002B-7B28-4 . ISSN 1618-0607. PMID 27053239. S2CID 36454231.
^ Эберл, Клаудия; Ринг, Диана; Мюнх, Филипп К.; Бойтлер, Маркус; Бейсик, Марияна; Слэк, Эмма Каролина; Шварцер, Мартин; Сруткова, Дагмар; Ланге, Анна; Фрик, Джулия С.; Бляйх, Андре (10.01.2020). «Воспроизводимая колонизация безмикробных мышей с помощью олигомикробиоты мышей в разных условиях содержания животных». Frontiers in Microbiology . 10 : 2999. doi : 10.3389/fmicb.2019.02999 . ISSN 1664-302X. PMC 6965490. PMID 31998276 .