Белковый микрочип (или белковый чип ) — это высокопроизводительный метод, используемый для отслеживания взаимодействий и активности белков, а также для определения их функции и определения функции в больших масштабах. [1] Его главное преимущество заключается в том, что можно отслеживать большое количество белков параллельно. Чип состоит из опорной поверхности, такой как предметное стекло, нитроцеллюлозная мембрана, шарик или микротитровальный планшет , с которой связан массив белков захвата. [2] Молекулы зонда , обычно помеченные флуоресцентным красителем, добавляются в массив. Любая реакция между зондом и иммобилизованным белком испускает флуоресцентный сигнал, который считывается лазерным сканером . [3] Белковые микрочипы являются быстрыми, автоматизированными, экономичными и высокочувствительными, потребляющими небольшие количества образцов и реагентов. [4] Концепция и методология белковых микрочипов были впервые представлены и проиллюстрированы в микрочипах антител (также называемых матрицей антител ) в 1983 году в научной публикации [5] и серии патентов. [6] Высокопроизводительную технологию, лежащую в основе белковых микрочипов, было относительно легко разработать, поскольку она основана на технологии, разработанной для ДНК-микрочипов , [7] которые стали наиболее широко используемыми микрочипами .
Белковые микрочипы были разработаны из-за ограничений использования ДНК-микрочипов для определения уровней экспрессии генов в протеомике . Количество мРНК в клетке часто не отражает уровни экспрессии белков, которым они соответствуют. Поскольку обычно именно белок, а не мРНК, играет функциональную роль в клеточном ответе, требовался новый подход. Кроме того, посттрансляционные модификации , которые часто имеют решающее значение для определения функции белка, не видны на ДНК-микрочипах. [8] Белковые микрочипы заменяют традиционные методы протеомики, такие как 2D-гель-электрофорез или хроматография , которые были трудоемкими, занимали много времени и не подходили для анализа малораспространенных белков.
Белки выстраиваются на твердой поверхности, такой как предметные стекла микроскопа, мембраны, шарики или микротитровальные пластины. Функция этой поверхности заключается в обеспечении поддержки, на которой белки могут быть иммобилизованы. Она должна демонстрировать максимальные связывающие свойства, сохраняя белок в его нативной конформации, чтобы его связывающая способность сохранялась. Предметные стекла микроскопа, изготовленные из стекла или кремния, являются популярным выбором, поскольку они совместимы с легкодоступными роботизированными укладчиками и лазерными сканерами, которые были разработаны для технологии ДНК-микрочипов. Слайды из нитроцеллюлозной пленки широко приняты в качестве субстрата с наивысшим связыванием белка для приложений белковых микрочипов.
Затем выбранная твердая поверхность покрывается покрытием, которое должно одновременно выполнять функции иммобилизации белка, предотвращения его денатурации , ориентации его в соответствующем направлении, чтобы его сайты связывания были доступны, и обеспечения гидрофильной среды, в которой может происходить реакция связывания. Оно также должно демонстрировать минимальное неспецифическое связывание, чтобы минимизировать фоновый шум в системах обнаружения. Кроме того, оно должно быть совместимо с различными системами обнаружения. Иммобилизующие агенты включают слои алюминия или золота, гидрофильные полимеры и полиакриламидные гели или обработку аминами , альдегидом или эпоксидной смолой . Для нанесения покрытия на поверхность подложки используются тонкопленочные технологии, такие как физическое осаждение из паровой фазы (PVD) и химическое осаждение из паровой фазы (CVD).
Водная среда необходима на всех этапах производства и эксплуатации массива для предотвращения денатурации белка. Поэтому буферы образцов содержат высокий процент глицерина (для снижения точки замерзания), а влажность производственной среды тщательно регулируется. Микролунки имеют двойное преимущество: они обеспечивают водную среду и предотвращают перекрестное загрязнение между образцами.
В наиболее распространенном типе белкового массива роботы размещают большое количество белков или их лигандов на покрытой твердой подложке в заранее определенном шаблоне. Это известно как роботизированная контактная печать или роботизированное нанесение пятен. Другой метод изготовления — струйная печать , бесконтактный метод распыления полимеров белка на твердой поверхности по требованию. [9] Пьезоэлектрическое нанесение пятен — метод, аналогичный струйной печати. Печатная головка перемещается по массиву и в каждой точке использует электрическую стимуляцию для доставки молекул белка на поверхность с помощью крошечных струй. Это также бесконтактный процесс. [10] Фотолитография — четвертый метод нанесения белков на поверхность. Свет используется совместно с фотошаблонами , непрозрачными пластинами с отверстиями или прозрачными пленками , которые позволяют свету просвечивать в определенном шаблоне. Затем серия химических обработок позволяет нанести белок в желаемом шаблоне на материал под фотошаблоном. [11]
Молекулы захвата, выстроенные на твердой поверхности, могут быть антителами , антигенами , аптамерами (лигандами на основе нуклеиновых кислот), аффителами (небольшими молекулами, сконструированными для имитации моноклональных антител) или полноразмерными белками. Источниками таких белков являются системы экспрессии на основе клеток для рекомбинантных белков , очистка из природных источников, производство in vitro с помощью бесклеточных систем трансляции и синтетические методы для пептидов . Многие из этих методов могут быть автоматизированы для высокопроизводительного производства, но необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать условий синтеза или экстракции, которые приводят к денатурированному белку, который, поскольку он больше не распознает своего партнера по связыванию, делает массив бесполезным.
Белки очень чувствительны к изменениям в их микроокружении. Это представляет собой проблему в поддержании белковых массивов в стабильном состоянии в течение длительных периодов времени. Методы in situ — изобретенные и опубликованные Мингюэ Хе и Майклом Тауссигом в 2001 году [12] [13] — включают синтез белков на чипе по мере необходимости, непосредственно из ДНК с использованием бесклеточных систем экспрессии белков. Поскольку ДНК является высокостабильной молекулой, она не разрушается со временем и поэтому подходит для длительного хранения. Этот подход также выгоден тем, что он обходит трудоемкие и часто дорогостоящие процессы раздельной очистки белков и клонирования ДНК , поскольку белки производятся и иммобилизуются одновременно за один шаг на поверхности чипа. Примерами методов in situ являются PISA (белковый массив in situ), NAPPA (белковый массив, программируемый нуклеиновой кислотой) и DAPA (массив ДНК в белковый массив).
В настоящее время для изучения биохимической активности белков используются три типа белковых микрочипов.
Аналитические микрочипы также известны как массивы захвата. В этой технике библиотека антител, аптамеров или аффител выстраивается на поверхности подложки. Они используются в качестве молекул захвата, поскольку каждый из них специфически связывается с определенным белком. Массив зондируется сложным белковым раствором, таким как клеточный лизат . Анализ полученных реакций связывания с использованием различных систем обнаружения может предоставить информацию об уровнях экспрессии определенных белков в образце, а также измерениях связывающих сродств и специфичностей. Этот тип микрочипов особенно полезен при сравнении экспрессии белков в различных растворах. Например, реакцию клеток на определенный фактор можно определить, сравнивая лизаты клеток, обработанных определенными веществами или выращенных в определенных условиях, с лизатами контрольных клеток. Другое применение — идентификация и профилирование больных тканей.
Микрочипы белков с обратной фазой (RPPA) включают сложные образцы, такие как лизаты тканей. Клетки изолируются из различных интересующих тканей и лизируются. Лизат выстраивается на микрочипе и исследуется антителами против интересующего целевого белка. Эти антитела обычно обнаруживаются с помощью хемилюминесцентных , флуоресцентных или колориметрических анализов. Референтные пептиды печатаются на слайдах, чтобы обеспечить количественную оценку белка в лизатах образцов. RPA позволяют определять наличие измененных белков или других агентов, которые могут быть результатом заболевания. В частности, посттрансляционные модификации, которые обычно изменяются в результате заболевания, можно обнаружить с помощью RPA. [14]
Функциональные белковые микрочипы (также известные как целевые белковые массивы) конструируются путем иммобилизации большого количества очищенных белков и используются для идентификации взаимодействий белок-белок, белок-ДНК, белок- РНК , белок- фосфолипид и белок-малая молекула, для анализа ферментативной активности и для обнаружения антител и демонстрации их специфичности. Они отличаются от аналитических массивов тем, что функциональные белковые массивы состоят из массивов, содержащих полноразмерные функциональные белки или белковые домены. Эти белковые чипы используются для изучения биохимической активности всего протеома в одном эксперименте.
Ключевым элементом в любом функциональном анализе на основе белковых микрочипов является то, что выстроенные белки должны сохранять свою нативную структуру, чтобы на поверхности массива могли происходить значимые функциональные взаимодействия. Преимущества контроля точного режима поверхностного прикрепления с помощью соответствующей аффинной метки заключаются в том, что иммобилизованные белки будут иметь однородную ориентацию, что приведет к более высокой удельной активности и более высокому отношению сигнал/шум в анализах с меньшими помехами от неспецифических взаимодействий. [15] [16]
Методы обнаружения белковых массивов должны давать высокий сигнал и низкий фоновый уровень. Наиболее распространенным и широко используемым методом обнаружения является флуоресцентная маркировка, которая является высокочувствительной, безопасной и совместимой с легкодоступными микрочиповыми лазерными сканерами. Могут использоваться и другие метки, такие как аффинные, фотохимические или радиоизотопные метки. Эти метки прикрепляются к самому зонду и могут мешать реакции зонда с целевым белком. Поэтому доступен ряд методов обнаружения без меток, таких как поверхностный плазмонный резонанс (SPR), углеродные нанотрубки, датчики на основе углеродных нанопроволок (где обнаружение происходит посредством изменений проводимости) и кантилеверы микроэлектромеханической системы (MEMS). [17] Все эти методы обнаружения без меток являются относительно новыми и пока не подходят для обнаружения взаимодействия белков с высокой пропускной способностью; однако они предлагают многообещающие результаты на будущее. Иммуноанализы на тиол-еновых «синтетических бумажных» микропиллярных каркасах показали, что генерируют превосходный флуоресцентный сигнал. [18]
Количественное определение белка на стеклянных предметных стеклах, покрытых нитроцеллюлозой, может использовать ближнее ИК-флуоресцентное обнаружение. Это ограничивает помехи из-за автофлуоресценции нитроцеллюлозы на длинах волн УФ, используемых для стандартных флуоресцентных зондов обнаружения. [19]
Существует пять основных областей применения белковых массивов: диагностика, протеомика, функциональный анализ белков, характеристика антител и разработка методов лечения.
Диагностика включает в себя обнаружение антигенов и антител в образцах крови; профилирование сыворотки для обнаружения новых биомаркеров заболеваний ; мониторинг состояний заболевания и ответов на терапию в персонализированной медицине; мониторинг окружающей среды и продуктов питания. Цифровой биоанализ является примером использования белкового микрочипа в диагностических целях. В этой технологии массив микролунок на стеклянном/полимерном чипе засевается магнитными шариками (покрытыми флуоресцентно мечеными антителами), подвергается воздействию целевых антигенов, а затем характеризуется микроскопом посредством подсчета флуоресцентных лунок. Недавно была продемонстрирована экономически эффективная платформа изготовления (с использованием полимеров OSTE ) для таких массивов микролунок, и модельная система биоанализа была успешно охарактеризована. [20]
Протеомика занимается профилированием экспрессии белков, то есть определением того, какие белки экспрессируются в лизате конкретной клетки.
Функциональный анализ белков — это идентификация белок-белковых взаимодействий (например, идентификация членов белкового комплекса), белок-фосфолипидных взаимодействий, малых молекул-мишеней, ферментативных субстратов (в частности, субстратов киназ ) и лигандов рецепторов.
Характеристика антител включает в себя характеристику перекрестной реактивности , специфичности и картирования эпитопов .
Разработка методов лечения включает разработку антигенспецифической терапии аутоиммунных заболеваний , рака и аллергии; выявление целевых малых молекул, которые потенциально могут быть использованы в качестве новых лекарственных средств.
Несмотря на значительные инвестиции, сделанные несколькими компаниями, белковые чипы еще не заполонили рынок. Производители обнаружили, что с белками на самом деле довольно сложно обращаться. Производство надежных, последовательных, высокопроизводительных белков, которые правильно свернуты и функциональны, сопряжено с трудностями, поскольку они часто приводят к низкому выходу белков из-за сниженной растворимости и образования включений. [ необходима цитата ] Белковый чип требует гораздо больше этапов при своем создании, чем ДНК-чип .
Существует ряд подходов к этой проблеме, которые принципиально различаются в зависимости от того, иммобилизованы ли белки посредством неспецифических, плохо определенных взаимодействий или посредством определенного набора известных взаимодействий. Первый подход привлекателен своей простотой и совместим с очищенными белками, полученными из нативных или рекомбинантных источников [21] [22], но страдает от ряда рисков. Наиболее заметные из них связаны с неконтролируемой природой взаимодействий между каждым белком и поверхностью; в лучшем случае это может привести к образованию гетерогенной популяции белков, в которых активные центры иногда закрыты поверхностью; в худшем случае это может полностью разрушить активность из-за частичного или полного поверхностно-опосредованного разворачивания иммобилизованного белка.
Проблемы включают в себя: 1) поиск поверхности и метода прикрепления, которые позволяют белкам сохранять свою вторичную или третичную структуру и, таким образом, их биологическую активность и их взаимодействие с другими молекулами, 2) создание массива с длительным сроком хранения, чтобы белки на чипе не денатурировали в течение короткого времени, 3) идентификация и изоляция антител или других молекул захвата против каждого белка в геноме человека, 4) количественная оценка уровней связанного белка с обеспечением чувствительности и избеганием фонового шума, 5) извлечение обнаруженного белка из чипа для дальнейшего его анализа, 6) снижение неспецифического связывания агентами захвата, 7) емкость чипа должна быть достаточной, чтобы обеспечить максимально полную визуализацию протеома; обильные белки подавляют обнаружение менее обильных белков, таких как сигнальные молекулы и рецепторы, которые, как правило, представляют больший терапевтический интерес. [23]