stringtranslate.com

Бисульфитное секвенирование

Рисунок 1: Схема бисульфитной конверсии образца последовательности геномной ДНК. Нуклеотиды синего цвета представляют собой неметилированные цитозины, преобразованные в урацилы бисульфитом, а красные нуклеотиды представляют собой 5-метилцитозины, устойчивые к преобразованию.
Рисунок 2: Схема химической реакции, лежащей в основе катализируемого бисульфитом превращения цитозина в урацил.

Бисульфитное [1] секвенирование (также известное как бисульфитное секвенирование ) представляет собой использование бисульфитной обработки ДНК перед рутинным секвенированием для определения характера метилирования . Метилирование ДНК было первой обнаруженной эпигенетической меткой и остается наиболее изученной. У животных он преимущественно включает добавление метильной группы к положению углерода-5 остатков цитозина динуклеотида CpG и участвует в репрессии транскрипционной активности .

Обработка ДНК бисульфитом превращает остатки цитозина в урацил , но оставляет остатки 5-метилцитозина незатронутыми. Следовательно, ДНК, обработанная бисульфитом, сохраняет только метилированные цитозины. Таким образом, обработка бисульфитом вносит специфические изменения в последовательность ДНК , которые зависят от статуса метилирования отдельных остатков цитозина, что дает информацию с разрешением одного нуклеотида о статусе метилирования сегмента ДНК. Для получения этой информации можно выполнить различные анализы измененной последовательности. Таким образом, цель этого анализа сводится к дифференциации однонуклеотидных полиморфизмов (цитозинов и тимидина ), возникающих в результате конверсии бисульфита (рис. 1).

Методы

При бисульфитном секвенировании применяются обычные методы секвенирования геномной ДНК, обработанной бисульфитом, для определения статуса метилирования динуклеотидов CpG. Другие стратегии, не связанные с секвенированием, также используются для исследования метилирования в определенных локусах или на уровне всего генома . Все стратегии предполагают, что бисульфит-индуцированное превращение неметилированных цитозинов в урацил завершено, и это служит основой всех последующих методов. В идеале используемый метод должен определять статус метилирования отдельно для каждой аллели . Альтернативные методы бисульфитного секвенирования включают комбинированный бисульфитный рестрикционный анализ и иммунопреципитацию метилированной ДНК (MeDIP).

Методики анализа ДНК, обработанной бисульфитом, постоянно разрабатываются. Для обобщения этих быстро развивающихся методологий было написано множество обзорных статей. [2] [3] [4] [5]

В целом методологии можно разделить на стратегии, основанные на ПЦР, специфичной для метилирования (MSP) (рис. 4), и стратегии, использующие полимеразную цепную реакцию (ПЦР), выполняемую в условиях, не специфичных для метилирования (рис. 3). В методах, основанных на микрочипах, также используется ПЦР, основанная на условиях, неспецифичных для метилирования.

Методы ПЦР, не специфичные для метилирования

Рисунок 3: Методы анализа метилирования ДНК, не основанные на ПЦР, специфичной для метилирования. После бисульфитной конверсии геномную ДНК амплифицируют с помощью ПЦР, которая не делает различия между метилированными и неметилированными последовательностями. Затем используются многочисленные доступные методы для распознавания на основе изменений внутри ампликона в результате преобразования бисульфита.

Прямое секвенирование

В первом опубликованном методе анализа метилирования с использованием ДНК, обработанной бисульфитом, использовалась ПЦР и стандартное секвенирование ДНК дидезоксинуклеотидов для прямого определения нуклеотидов, устойчивых к преобразованию бисульфита. [6] Праймеры разрабатываются так, чтобы быть специфичными как для цепи, так и для бисульфита (т.е. праймеры, содержащие не-CpG цитозины, так что они не комплементарны ДНК, не обработанной бисульфитом), фланкирующие (но не вовлекающие) сайт метилирования. представляет интерес. Следовательно, он будет амплифицировать как метилированные, так и неметилированные последовательности, в отличие от ПЦР, специфичной для метилирования. Все сайты неметилированных цитозинов представлены в виде тиминов в результирующей амплифицированной последовательности смысловой цепи и в виде аденинов в амплифицированной антисмысловой цепи. Благодаря включению адаптеров высокопроизводительного секвенирования в праймеры для ПЦР продукты ПЦР можно секвенировать с помощью массово-параллельного секвенирования. Альтернативно и трудоемко, продукт ПЦР можно клонировать и секвенировать. Методы вложенной ПЦР можно использовать для улучшения качества продукта при секвенировании .

Все последующие методы анализа метилирования ДНК с использованием ДНК, обработанной бисульфитом, основаны на этом отчете Frommer et al. (Фигура 2). [6] Хотя большинство других методов не являются истинными методами, основанными на секвенировании, термин «бисульфитное секвенирование» часто используется для описания методов анализа метилирования ДНК с бисульфитной конверсией в целом.

Пиросеквенирование

Пиросеквенирование также использовалось для анализа ДНК, обработанной бисульфитом, без использования ПЦР, специфичной для метилирования. [7] [8] После ПЦР-амплификации интересующей области пиросеквенирование используется для определения преобразованной бисульфитом последовательности специфических сайтов CpG в этой области. Соотношение C-к-T в отдельных сайтах можно определить количественно на основе количества включения C и T во время расширения последовательности. Основным ограничением этого метода является стоимость технологии. Тем не менее, пиросеквенирование вполне позволяет расширить методы скрининга с высокой пропускной способностью .

Вариант этой методики, описанный Wong et al. , использует аллель-специфичные праймеры, которые включают однонуклеотидные полиморфизмы в последовательность праймера для секвенирования, что позволяет проводить раздельный анализ материнских и отцовских аллелей . [9] Этот метод особенно полезен для анализа геномного импринтинга .

Чувствительный к метилированию одноцепочечный конформационный анализ (MS-SSCA)

Этот метод основан на методе анализа одноцепочечного конформационного полиморфизма (SSCA), разработанном для анализа однонуклеотидного полиморфизма (SNP). [10] SSCA различает одноцепочечные фрагменты ДНК идентичного размера, но различной последовательности на основе дифференциальной миграции в неденатурирующем электрофорезе . В MS-SSCA это используется для различения обработанных бисульфитом и амплифицированных ПЦР областей, содержащих интересующие сайты CpG. Хотя SSCA не обладает чувствительностью, когда присутствует только разница в один нуклеотид , обработка бисульфитом часто приводит к ряду преобразований C-to-T в большинстве представляющих интерес областей, и результирующая чувствительность приближается к 100%. MS-SSCA также обеспечивает полуколичественный анализ степени метилирования ДНК на основе соотношения интенсивностей полос. Однако этот метод предназначен для оценки всех сайтов CpG в целом в интересующей области, а не отдельных сайтов метилирования.

Анализ плавления высокого разрешения (HRM)

Еще одним методом дифференциации преобразованной ДНК от непреобразованной, обработанной бисульфитом, является использование анализа плавления высокого разрешения (HRM), количественного метода на основе ПЦР , первоначально разработанного для различения SNP. [11] ПЦР- ампликоны анализируются непосредственно путем изменения температуры и, как следствие, высвобождения интеркалирующего флуоресцентного красителя во время плавления. Степень метилирования, представленная содержанием C-to-T в ампликоне , определяет скорость плавления и последующее высвобождение красителя. Этот метод позволяет проводить прямой количественный анализ в одной пробирке, но оценивает метилирование в амплифицированной области в целом, а не в конкретных сайтах CpG .

Расширение однонуклеотидного праймера, чувствительного к метилированию (MS-SnuPE)

MS-SnuPE использует метод удлинения праймера, изначально разработанный для анализа однонуклеотидных полиморфизмов . [12] ДНК подвергается бисульфитному преобразованию, и бисульфит-специфичные праймеры отжигаются с последовательностью до пары оснований непосредственно перед интересующим CpG. Праймеру позволяют удлинить одну пару оснований до C (или T) с помощью дидезоксинуклеотидов , оканчивающихся ДНК-полимеразой , и соотношение C и T определяют количественно.

Для определения этого соотношения C:T можно использовать ряд методов. Вначале MS-SnuPE полагался на радиоактивные ddNTP в качестве репортера расширения праймера. Также можно использовать методы на основе флуоресценции или пиросеквенирование . [13] Однако масс-спектрометрический анализ с матричной лазерной десорбцией и ионизацией/временем пролета ( MALDI-TOF ) для различения двух полиморфных продуктов удлинения праймера может быть использован, по сути, на основе анализа GOOD, разработанного для генотипирования SNP. . Ионно-парная высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой (IP-RP- ВЭЖХ ) также использовалась для различения продуктов удлинения праймера. [14]

Расщепление по основанию/MALDI-TOF

Недавно описанный метод Ehrich et al. дополнительно использует преимущества бисульфитных преобразований, добавляя стадию расщепления, специфичного для оснований, для улучшения информации, полученной в результате изменений нуклеотидов. [15] При первом использовании in vitro транскрипции интересующей области в РНК (путем добавления сайта промотора РНК-полимеразы к праймеру ПЦР при первоначальной амплификации) можно использовать РНКазу А для расщепления транскрипта РНК в сайтах, специфичных для оснований. Поскольку РНКаза А расщепляет РНК специфически по рибонуклеотидам цитозина и урацила , специфичность по основаниям достигается за счет добавления устойчивого к расщеплению dTTP , когда желательно цитозин-специфическое (C-специфическое) расщепление, и включения dCTP, когда урацил-специфическое (U-специфическое) расщепление. желательно. Расщепленные фрагменты затем можно проанализировать с помощью MALDI-TOF . Обработка бисульфитом приводит либо к введению/удалению сайтов расщепления за счет превращений C-в-U, либо к сдвигу массы фрагмента за счет превращений G-в-A в амплифицированной обратной цепи. C-специфическое расщепление будет специфично разрезаться по всем метилированным сайтам CpG . Анализируя размеры полученных фрагментов, можно определить конкретный характер метилирования ДНК CpG-сайтов внутри региона, а не определить степень метилирования региона в целом. Этот метод продемонстрировал эффективность высокопроизводительного скрининга , позволяя экономически эффективно исследовать многочисленные сайты CpG во многих тканях.

ПЦР, специфичная для метилирования (MSP)

Рисунок 4: ПЦР, специфичная для метилирования, представляет собой чувствительный метод избирательной амплификации и обнаружения интересующей метилированной области с использованием специфичных к метилированию праймеров на геномной ДНК, преобразованной бисульфитом. Такие праймеры будут отжигаться только с метилированными последовательностями и, следовательно, содержащими 5-метилцитозины , устойчивые к преобразованию бисульфитом. Альтернативно можно использовать неметилированные специфические праймеры.

Этот альтернативный метод анализа метилирования также использует ДНК, обработанную бисульфитом, но позволяет избежать необходимости секвенировать интересующую область. [16] Вместо этого пары праймеров конструируются так, чтобы быть «специфичными к метилированию», включая последовательности, дополняющие только непреобразованные 5-метилцитозины , или, наоборот, «специфичные к неметилированию», дополняющие тимины , преобразованные из неметилированных цитозинов. Метилирование определяется способностью конкретного праймера достигать амплификации. Этот метод особенно полезен для исследования CpG-островков с возможно высокой плотностью метилирования, поскольку увеличение количества пар CpG в праймере повышает специфичность анализа. Размещение пары CpG на 3'-конце праймера также повышает чувствительность. В первоначальном отчете с использованием MSP описывалась достаточная чувствительность для обнаружения метилирования 0,1% аллелей . В целом, MSP и связанные с ним протоколы считаются наиболее чувствительными при проверке статуса метилирования в определенном локусе .

Метод MethyLight основан на MSP, но обеспечивает количественный анализ с помощью количественной ПЦР . [17] Используются метилированные специфичные праймеры, а также метилированный специфичный флуоресцентный репортерный зонд, который отжигается с амплифицированной областью. Альтернативно, праймеры или зонды могут быть созданы без специфичности метилирования, если необходимо различать пары CpG внутри задействованных последовательностей. Количественное определение проводят относительно метилированной эталонной ДНК. Модификация этого протокола для повышения специфичности ПЦР для успешно преобразованной бисульфитом ДНК (ConLight-MSP) использует дополнительный зонд для непреобразованной бисульфитом ДНК для количественной оценки этой неспецифической амплификации. [18]

Дальнейшая методика с использованием MSP-амплифицированной ДНК анализирует продукты с использованием анализа кривой плавления (Mc-MSP). [19] Этот метод амплифицирует преобразованную бисульфитом ДНК как с метилированными, так и с неметилированными специфичными праймерами и определяет количественное соотношение двух продуктов путем сравнения дифференциальных пиков, полученных при анализе кривой плавления. Был внедрен метод анализа плавления с высоким разрешением, который использует как количественную ПЦР , так и анализ плавления, в частности, для чувствительного обнаружения низкого уровня метилирования [20].

Методы на основе микрочипов

Методы на основе микрочипов являются логическим продолжением технологий, доступных для анализа ДНК, обработанной бисульфитом, и позволяют проводить полногеномный анализ метилирования. [21] Олигонуклеотидные микрочипы разрабатываются с использованием пар олигонуклеотидных гибридизационных зондов, нацеленных на интересующие сайты CpG . Один комплементарен неизмененной метилированной последовательности, а другой комплементарен неметилированной последовательности, преобразованной из C в U. Зонды также являются бисульфит-специфичными, что предотвращает связывание с ДНК, неполностью преобразованной бисульфитом. Анализ метилирования Illumina — это один из таких анализов, в котором применяется технология бисульфитного секвенирования на уровне микрочипов для получения данных о метилировании всего генома.

Ограничения

5-гидроксиметилцитозин

Бисульфитное секвенирование широко используется в геномах млекопитающих, однако возникли осложнения с открытием новой модификации ДНК млекопитающих 5-гидроксиметилцитозина . [22] [23] 5-Гидроксиметилцитозин превращается в цитозин-5-метилсульфонат при обработке бисульфитом, который затем читается как C при секвенировании. [24] Таким образом, бисульфитное секвенирование не может различать 5-метилцитозин и 5-гидроксиметилцитозин. Это означает, что результат бисульфитного секвенирования больше нельзя определять как исключительно метилирование ДНК, поскольку он представляет собой смесь 5-метилцитозина и 5-гидроксиметилцитозина. Разработка Чуан Хэ в Чикагском университете окислительного бисульфитного секвенирования с помощью Tet теперь позволяет различать две модификации с разрешением по одному основанию. [25]

Неполное преобразование

Бисульфитное секвенирование основано на превращении каждого отдельного неметилированного остатка цитозина в урацил. Если конверсия неполная, последующий анализ будет неправильно интерпретировать непреобразованные неметилированные цитозины как метилированные цитозины, что приведет к ложноположительным результатам по метилированию. Только цитозины в одноцепочечной ДНК подвержены атаке бисульфита, поэтому денатурация анализируемой ДНК имеет решающее значение. [2] Важно убедиться, что параметры реакции, такие как температура и концентрация соли, подходят для поддержания ДНК в одноцепочечной конформации и обеспечивают полное преобразование. Сообщается, что встраивание ДНК в агарозный гель повышает скорость конверсии за счет физического разделения цепей ДНК. [26] Неполные коэффициенты конверсии можно оценить и скорректировать после секвенирования, включив в библиотеку секвенирования внутренний контроль, такой как ДНК фага лямбда (которая, как известно, неметилирована), или путем выравнивания считываний бисульфитного секвенирования с известной неметилированной областью в организм, такой как геном хлоропласта. [27]

Деградация ДНК при обработке бисульфитом

Основной проблемой бисульфитного секвенирования является деградация ДНК, происходящая одновременно с конверсией. Условия, необходимые для полной конверсии, такие как длительное время инкубации, повышенная температура и высокая концентрация бисульфита, могут привести к деградации около 90% инкубированной ДНК. [28] Учитывая, что исходное количество ДНК часто ограничено, такая обширная деградация может быть проблематичной. Деградация происходит в виде депуринации , приводящей к случайным разрывам нитей. [29] Следовательно, чем длиннее желаемый ампликон ПЦР , тем более ограниченным будет, вероятно, количество интактных молекул матрицы. Это может привести к сбою ПЦР-амплификации или потере количественно точной информации об уровнях метилирования в результате ограниченного отбора образцов молекул-матриц. Таким образом, важно оценить степень деградации ДНК, возникающую в результате используемых условий реакции, и рассмотреть, как это повлияет на желаемый ампликон . Для минимизации деградации ДНК также можно использовать методы, такие как циклическое изменение температуры инкубации. [29]

В 2020 году биолаборатории Новой Англии разработали NEBNext Enzymatic Mmethyl-seq, альтернативный ферментативный подход, позволяющий минимизировать повреждение ДНК. [30]

Другие проблемы

Потенциально значимой проблемой после обработки бисульфитом является неполное десульфирование пиримидиновых остатков из - за недостаточного подщелачивания раствора. Это может ингибировать некоторые ДНК-полимеразы , что затрудняет последующую ПЦР. Однако этой ситуации можно избежать, контролируя pH раствора, чтобы гарантировать завершение десульфирования. [2]

Последнее беспокойство вызывает то, что обработка бисульфитом значительно снижает уровень сложности образца, что может быть проблематичным, если необходимо выполнить несколько реакций ПЦР (2006). [5] Разработка праймера более сложна, и более часта несоответствующая перекрестная гибридизация.

Приложения: полногеномный анализ метилирования.

Достижения в области бисульфитного секвенирования привели к возможности их применения в масштабе всего генома , тогда как ранее глобальное измерение метилирования ДНК было возможно только с использованием других методов, таких как геномное сканирование по рестрикционным ориентирам . Картирование эпигенома человека рассматривается многими учеными как логическое продолжение завершения проекта «Геном человека» . [31] [32] Эта эпигеномная информация будет важна для понимания того, как функция генетической последовательности реализуется и регулируется. Поскольку эпигеном менее стабилен, чем геном, считается, что он важен во взаимодействиях гена и окружающей среды . [33]

Однако эпигеномное картирование по своей сути более сложное, чем секвенирование генома , поскольку эпигеном гораздо более изменчив, чем геном . Эпигеном человека меняется с возрастом, различается в разных тканях, изменяется под воздействием факторов окружающей среды и демонстрирует отклонения при заболеваниях. Однако такое богатое эпигеномное картирование, отражающее разные возрасты, типы тканей и болезненные состояния, могло бы дать ценную информацию о нормальном функционировании эпигенетических меток, а также о механизмах, ведущих к старению и болезням.

Прямые преимущества эпигеномного картирования включают вероятные достижения в технологии клонирования . Считается, что неудачи в создании клонированных животных с нормальной жизнеспособностью и продолжительностью жизни являются результатом несоответствующих моделей эпигенетических меток. Кроме того, аберрантные паттерны метилирования хорошо характеризуются при многих видах рака . Глобальное гипометилирование приводит к снижению геномной стабильности, тогда как локальное гиперметилирование промоторов генов-супрессоров опухолей часто приводит к потере их функции . Конкретные закономерности метилирования указывают на конкретные типы рака, имеют прогностическую ценность и могут помочь выбрать лучший курс лечения. [32]

Крупномасштабные усилия по картированию эпигенома проводятся по всему миру и организованы в рамках проекта «Эпигеном человека» . [33] Это основано на многоуровневой стратегии, при которой бисульфитное секвенирование используется для получения профилей метилирования с высоким разрешением для ограниченного числа эталонных эпигеномов, в то время как менее тщательный анализ выполняется на более широком спектре образцов. Этот подход призван максимизировать понимание, полученное от заданного объема ресурсов, поскольку картирование всего генома с высоким разрешением остается дорогостоящим мероприятием.

Было показано, что анализ набора генов (например, с использованием таких инструментов, как DAVID и GoSeq) дает серьезные искажения при применении к данным высокопроизводительного метилирования (например, полногеномное бисульфитное секвенирование); Было высказано предположение, что это можно исправить с помощью перестановок меток образцов или использования статистической модели для контроля различий в количестве зондов CpG/сайтов CpG, нацеленных на каждый ген. [34]

Окислительное бисульфитное секвенирование

5-Метилцитозин и 5-гидроксиметилцитозин при бисульфитном секвенировании читаются как C. [24] Окислительное бисульфитное секвенирование — это метод распознавания 5-метилцитозина и 5-гидроксиметилцитозина с разрешением по одному основанию. В этом методе используется специфическое (с помощью Tet) химическое окисление 5-гидроксиметилцитозина до 5-формилцитозина, который впоследствии превращается в урацил во время обработки бисульфитом. [35] Единственное основание, которое тогда читается как C, — это 5-метилцитозин, что дает карту истинного статуса метилирования в образце ДНК. Уровни 5-гидроксиметилцитозина также можно определить количественно, измеряя разницу между бисульфитным и окислительным бисульфитным секвенированием.

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Чаттерджи А., Стоквелл П.А., Роджер Э.Дж. и Морисон И.М. 2012. Сравнение программного обеспечения для выравнивания данных полногеномных бисульфитных последовательностей. Исследования нуклеиновых кислот 40(10): e79.
  2. ^ abc Fraga MF, Эстеллер М (сентябрь 2002 г.). «Метилирование ДНК: профиль методов и приложений». БиоТехники . 33 (3): 632, 634, 636–49. дои : 10.2144/02333rv01 . ПМИД  12238773.
  3. ^ Эль-Маарри О (2003). «Методы: метилирование ДНК». Пероксисомальные расстройства и регуляция генов . Достижения экспериментальной медицины и биологии. Том. 544. стр. 197–204. дои : 10.1007/978-1-4419-9072-3_23. ISBN 978-0-306-48174-1. ПМИД  14713229.
  4. ^ Лэрд П.В. (апрель 2003 г.). «Сила и перспективы маркеров метилирования ДНК». Обзоры природы. Рак . 3 (4): 253–66. дои : 10.1038/nrc1045. PMID  12671664. S2CID  19574628.
  5. ^ ab Каллинан, Пенсильвания, Файнберг AP (апрель 2006 г.). «Новая наука эпигеномика». Молекулярная генетика человека . 15 Спецификация № 1 (90001): R95-101. дои : 10.1093/hmg/ddl095 . ПМИД  16651376.
  6. ^ ab Фроммер М., Макдональд Л.Е., Миллар Д.С., Коллис С.М., Уотт Ф., Григг Г.В. и др. (март 1992 г.). «Протокол геномного секвенирования, который дает положительное отображение остатков 5-метилцитозина в отдельных цепях ДНК». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 89 (5): 1827–31. Бибкод : 1992PNAS...89.1827F. дои : 10.1073/pnas.89.5.1827 . ПМК 48546 . ПМИД  1542678. 
  7. ^ Колелла С., Шен Л., Баггерли К.А., Исса Дж.П., Крахе Р. (июль 2003 г.). «Чувствительный и количественный универсальный анализ метилирования сайтов CpG с помощью пиросеквенирования». БиоТехники . 35 (1): 146–50. дои : 10.2144/03351md01 . ПМИД  12866414.
  8. ^ Тост Дж., Данкер Дж., Гут И.Г. (июль 2003 г.). «Анализ и количественная оценка множественных вариабельных положений метилирования в CpG-островках методом пиросеквенирования». БиоТехники . 35 (1): 152–6. дои : 10.2144/03351md02 . ПМИД  12866415.
  9. ^ Вонг Х.Л., Бьюн Х.М., Кван Дж.М., Кампан М., Инглес С.А., Лэрд П.В., Ян А.С. (декабрь 2006 г.). «Быстрый и количественный метод анализа аллель-специфического метилирования ДНК». БиоТехники . 41 (6): 734–9. дои : 10.2144/000112305 . ПМИД  17191619.
  10. ^ Бьянко Т., Хасси Д., Добрович А. (1999). «Одноцепочечный конформационный анализ, чувствительный к метилированию (MS-SSCA): быстрый метод выявления и анализа метилирования». Человеческая мутация . 14 (4): 289–93. doi : 10.1002/(SICI)1098-1004(199910)14:4<289::AID-HUMU3>3.0.CO;2-A . PMID  10502775. S2CID  22814772.
  11. ^ Войдач Т.К., Добрович А. (2007). «Плавление с высоким разрешением, чувствительное к метилированию (MS-HRM): новый подход к чувствительной и высокопроизводительной оценке метилирования». Исследования нуклеиновых кислот . 35 (6): е41. doi : 10.1093/nar/gkm013. ПМЦ 1874596 . ПМИД  17289753. 
  12. ^ Гонсалго М.Л., Джонс, Пенсильвания (июнь 1997 г.). «Быстрое количественное определение различий метилирования в определенных сайтах с использованием чувствительного к метилированию удлинения однонуклеотидного праймера (Ms-SNuPE)». Исследования нуклеиновых кислот . 25 (12): 2529–31. дои : 10.1093/нар/25.12.2529. ПМЦ 146734 . ПМИД  9171109. 
  13. ^ Ульманн К., Бринкманн А., Толиат М.Р., Риттер Х., Нюрнберг П. (декабрь 2002 г.). «Оценка потенциального эпигенетического биомаркера с помощью количественного анализа полиморфизма метил-одиночных нуклеотидов». Электрофорез . 23 (24): 4072–9. дои : 10.1002/elps.200290023. PMID  12481262. S2CID  43737807.
  14. ^ Матин М.М., Баумер А., Хорнби Д.П. (октябрь 2002 г.). «Аналитический метод обнаружения различий метилирования в определенных хромосомных локусах с использованием удлинения праймера и обращенно-фазовой ВЭЖХ с ионными парами». Человеческая мутация . 20 (4): 305–11. дои : 10.1002/humu.10118 . PMID  12325026. S2CID  3178841.
  15. ^ Эрих М., Нельсон М.Р., Станссенс П., Забо М., Лилоглу Т., Ксинарианос Г. и др. (ноябрь 2005 г.). «Количественный высокопроизводительный анализ закономерностей метилирования ДНК путем специфического расщепления и масс-спектрометрии». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 102 (44): 15785–90. Бибкод : 2005PNAS..10215785E. дои : 10.1073/pnas.0507816102 . ПМК 1276092 . ПМИД  16243968. 
  16. ^ Герман Дж.Г. , Графф Дж.Р., Мёханен С., Нелькин Б.Д., Байлин С.Б. (сентябрь 1996 г.). «ПЦР, специфичная для метилирования: новый ПЦР-анализ статуса метилирования CpG-островков». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 93 (18): 9821–6. Бибкод : 1996PNAS...93.9821H. дои : 10.1073/pnas.93.18.9821 . ПМЦ 38513 . ПМИД  8790415. 
  17. ^ Идс Калифорния, Даненберг К.Д., Каваками К., Зальц Л.Б., Блейк С., Шибата Д. и др. (апрель 2000 г.). «MethyLight: высокопроизводительный анализ для измерения метилирования ДНК». Исследования нуклеиновых кислот . 28 (8): 32е–0. дои : 10.1093/нар/28.8.e32. ПМЦ 102836 . ПМИД  10734209. 
  18. ^ Рэнд К., Цюй В., Хо Т., Кларк С.Дж. , Моллой П. (июнь 2002 г.). «Обнаружение метилирования ДНК, специфичное для конверсии, с использованием полимеразной цепной реакции в реальном времени (ConLight-MSP) во избежание ложноположительных результатов». Методы . 27 (2): 114–20. дои : 10.1016/S1046-2023(02)00062-2. ПМИД  12095268.
  19. ^ Акей Д.Т., Акей Дж.М., Чжан К., Джин Л. (октябрь 2002 г.). «Анализ метилирования ДНК на основе высокопроизводительных подходов к кривой плавления». Геномика . 80 (4): 376–84. дои : 10.1006/geno.2002.6851. ПМИД  12376091.
  20. ^ Кристенсен Л.С., Микеска Т., Крипуй М., Добрович А. (апрель 2008 г.). «Чувствительный анализ плавления после ПЦР, специфичной для метилирования в реальном времени (SMART-MSP): высокопроизводительное и беззондовое количественное обнаружение метилирования ДНК». Исследования нуклеиновых кислот . 36 (7): е42. дои : 10.1093/нар/gkn113. ПМК 2367707 . ПМИД  18344521. 
  21. ^ Адорьян П., Дистлер Дж., Липшер Э., Модель F, Мюллер Дж., Пелет С. и др. (март 2002 г.). «Прогнозирование и обнаружение классов опухолей с помощью анализа метилирования ДНК на основе микрочипов». Исследования нуклеиновых кислот . 30 (5): 21д–21. дои : 10.1093/nar/30.5.e21. ПМК 101257 . ПМИД  11861926. 
  22. ^ Тахилиани М., Ко К.П., Шен Ю., Пастор В.А., Бандуквала Х., Брудной И. и др. Преобразование 5-метилцитозина в 5-гидроксиметилцитозин в ДНК млекопитающих партнером MLL TET1. Наука . 2009;324(5929):930-5.
  23. ^ Криауционис С., Хайнц Н. Основание ядерной ДНК 5-гидроксиметилцитозин присутствует в нейронах Пуркинье и головном мозге. Science.2009;324(5929):929-30.
  24. ^ аб Хуан Ю, Пастор В.А., Шен Ю, Тахилиани М, Лю Д.Р., Рао А. Поведение 5-гидроксиметилцитозина при бисульфитном секвенировании. PLOS ONE.2010;5(1):e8888.
  25. ^ Ю, М., Хон, Г.К., Шулвак, К.Е., Сонг, К., Джин, П., Рен, Б., Хе, К. Бисульфитное секвенирование 5-гидроксиметилцитозина с помощью Tet. Нат. Протоколы 2012 , 7 , 2159.
  26. ^ Олек А., Освальд Дж., Уолтер Дж. (декабрь 1996 г.). «Модифицированный и улучшенный метод анализа метилирования цитозина на основе бисульфита». Исследования нуклеиновых кислот . 24 (24): 5064–6. дои : 10.1093/нар/24.24.5064. ПМК 146326 . ПМИД  9016686. 
  27. ^ Нидерхут, Чад Э.; Бьюик, Адам Дж.; Цзи, Лесян; Алабади, Мэгди С.; Ким, Кён До; Ли, Цин; Рор, Николас А.; Рамбани, Адити; Берк, Джон М.; Удалл, Джошуа А.; Эгези, Кьедози; Шмутц, Джереми; Гримвуд, Джейн; Джексон, Скотт А.; Спрингер, Натан М. (27 сентября 2016 г.). «Широко распространенное естественное изменение метилирования ДНК у покрытосеменных растений». Геномная биология . 17 (1): 194. дои : 10.1186/s13059-016-1059-0 . ISSN  1474-760X. ПМК 5037628 . 
  28. ^ Грунау С., Кларк С.Дж., Розенталь А. (июль 2001 г.). «Бисульфитное геномное секвенирование: систематическое исследование критических экспериментальных параметров». Исследования нуклеиновых кислот . 29 (13): Е65-5. дои : 10.1093/nar/29.13.e65. ПМК 55789 . ПМИД  11433041. 
  29. ^ аб Эрих М., Золл С., Сур С., ван ден Бум Д. (2007). «Новый метод точной оценки качества ДНК после обработки бисульфитом». Исследования нуклеиновых кислот . 35 (5): е29. дои : 10.1093/нар/gkl1134. ПМК 1865059 . ПМИД  17259213. 
  30. ^ Готро, Изабель (29 сентября 2014 г.). «NEBNext End Prep Mix v1». протоколы.io . doi : 10.17504/protocols.io.cg4tyv . Проверено 19 мая 2021 г.
  31. ^ Эстеллер М (июнь 2006 г.). «Необходимость проекта эпигенома человека». Канцерогенез . 27 (6): 1121–5. doi : 10.1093/carcin/bgl033 . ПМИД  16699174.
  32. ^ аб Брэдбери Дж. (декабрь 2003 г.). «Проект эпигенома человека - запущен и работает». ПЛОС Биология . 1 (3): Е82. doi : 10.1371/journal.pbio.0000082 . ПМК 300691 . ПМИД  14691553. 
  33. ^ аб Джонс, Пенсильвания, Мартиенсен Р. (декабрь 2005 г.). «План проекта эпигенома человека: семинар AACR по эпигеному человека». Исследования рака . 65 (24): 11241–6. doi : 10.1158/0008-5472.CAN-05-3865. ПМИД  16357125.
  34. ^ Джелехер П., Хартнетт Л., Иган Л.Дж., Голден А., Раджа Али Р.А., Сои С. (август 2013 г.). «Анализ набора генов сильно необъективен, когда применяется к данным о полногеномном метилировании». Биоинформатика . 29 (15): 1851–7. doi : 10.1093/биоинформатика/btt311 . ПМИД  23732277.
  35. ^ Бут М.Дж., Бранко М.Р., Фиц Г., Оксли Д., Крюгер Ф., Рейк В. и др. количественное секвенирование 5-метилцитозина и 5-гидроксиметилцитозина с одноосновным разрешением. Наука. 2012;336(6083):934-7.

Внешние ссылки