Бромид этидия (или бромид гомодия , [2] хлоридная соль хлорида гомодия ) [3] [4] представляет собой интеркалирующий агент, обычно используемый в качестве флуоресцентной метки ( окраска нуклеиновой кислоты ) в лабораториях молекулярной биологии для таких методов, как электрофорез в агарозном геле . Его обычно называют EtBr , что также является сокращением от бромэтана . Чтобы избежать путаницы, некоторые лаборатории использовали для этой соли аббревиатуру EthBr . Под воздействием ультрафиолетового света он флуоресцирует оранжевым цветом, усиливаясь почти в 20 раз после связывания с ДНК . Под названием хомидий он широко использовался с 1950-х годов в ветеринарной медицине для лечения трипаносомоза у крупного рогатого скота. [5] Высокая частота устойчивости к противомикробным препаратам делает этот метод лечения непрактичным в некоторых регионах, где вместо него используется родственный хлорид изометамидия . Несмотря на его репутацию мутагена, тесты показали, что он обладает низкой мутагенностью без метаболической активации. [6] [7]
Как и большинство флуоресцентных соединений , бромистый этидий является ароматическим . Его основной гетероциклический фрагмент обычно известен как фенантридин , изомером которого является флуоресцентный краситель акридин . Максимумы поглощения EtBr в водном растворе находятся при 210 нм и 285 нм, что соответствует ультрафиолетовому свету . В результате этого возбуждения EtBr излучает оранжевый свет с длиной волны 605 нм. [8] [9]
Интенсивная флуоресценция бромида этидия после связывания с ДНК, вероятно, не связана с жесткой стабилизацией фенильного фрагмента , поскольку было показано, что фенильное кольцо выступает за пределы интеркалированных оснований. Фактически обнаружено, что фенильная группа почти перпендикулярна плоскости кольцевой системы, поскольку она вращается вокруг своей одинарной связи, чтобы найти положение, в котором она будет минимально сталкиваться с кольцевой системой. Вместо этого считается, что за это ответственно гидрофобное окружение, обнаруженное между парами оснований . Перемещаясь в эту гидрофобную среду и удаляясь от растворителя, катион этидия вынужден терять любые молекулы воды, которые были с ним связаны. Поскольку вода является высокоэффективным тушителем флуоресценции , удаление этих молекул воды позволяет этидию флуоресцировать. [ нужна цитата ]
Бромид этидия обычно используется для обнаружения нуклеиновых кислот в лабораториях молекулярной биологии. В случае ДНК это обычно двухцепочечная ДНК, полученная в результате ПЦР , рестрикционных гидролизатов и т. д. Одноцепочечную РНК также можно обнаружить, поскольку она обычно сворачивается сама в себя и, таким образом, обеспечивает локальное спаривание оснований для интеркалирования красителя. Для обнаружения обычно используется гель , содержащий нуклеиновые кислоты, помещенный на или под ультрафиолетовую лампу. Поскольку ультрафиолетовый свет вреден для глаз и кожи, гели, окрашенные бромидом этидия, обычно просматривают непрямым способом с помощью закрытой камеры, а флуоресцентные изображения записывают в виде фотографий. Если необходим прямой просмотр, глаза и открытая кожа зрителя должны быть защищены. В лаборатории интеркалирующие свойства уже давно используются для минимизации хромосомной конденсации, когда культура подвергается воздействию агентов, задерживающих митозы, во время сбора урожая. Полученные препараты на предметных стеклах обеспечивают более высокую степень разрешения и, следовательно, большую уверенность в определении структурной целостности хромосом при микроскопическом анализе. [ нужна цитата ]
Бромид этидия также используется при разделении фрагментов ДНК электрофорезом в агарозном геле . [10] Он добавляется в рабочий буфер и связывается путем интеркалирования между парами оснований ДНК. Когда агарозный гель освещают УФ-светом, полосы ДНК становятся видимыми. Интеркаляция EtBr может изменить свойства молекулы ДНК, такие как заряд, вес, конформация и гибкость. Поскольку подвижность молекул ДНК в агарозном геле измеряется относительно стандарта молекулярной массы, влияние EtBr может иметь решающее значение для определения размеров молекул. [11]
Бромид этидия также широко используется для уменьшения количества копий митохондриальной ДНК в пролиферирующих клетках. [12] Влияние EtBr на митохондриальную ДНК используется в ветеринарии для лечения трипаносомоза крупного рогатого скота, поскольку EtBr связывает молекулы ДНК кинетопластид и меняет их конформацию на форму Z-ДНК . Эта форма ингибирует репликацию ДНК кинетопластид, что смертельно для трипаносом. [13]
Хлоридная соль гомидия хлорид имеет такое же применение. [3] [4]
Бромид этидия можно добавлять в среду YPD и использовать в качестве ингибитора роста клеток. [14]
Сродство связывания катионных наночастиц с ДНК можно оценить путем конкурентного связывания с бромидом этидия. [15] [16]
Существуют альтернативы бромиду этидия, которые рекламируются как менее опасные и обладающие лучшими характеристиками. [17] [18] Например, некоторые исследователи используют несколько красителей на основе SYBR , а также появляются и другие новые пятна, такие как «Novel Juice». Красители SYBR менее мутагены, чем EtBr, согласно тесту Эймса с экстрактом печени. [19] Однако на самом деле было обнаружено, что SYBR Green I более мутагенен, чем EtBr, для бактериальных клеток, подвергающихся воздействию УФ (который используется для визуализации любого красителя). [20] То же самое может быть и с другими «более безопасными» красителями, но, хотя подробности о мутагенности и токсичности доступны [21], они не были опубликованы в рецензируемых журналах. В MSDS для SYBR Safe указано значение LD 50 для крыс более 5 г/кг, что выше, чем у EtBr (1,5 г/кг). Многие альтернативные красители суспендированы в ДМСО , что само по себе имеет последствия для здоровья, включая повышенное поглощение кожей органических соединений. [19] Несмотря на преимущество использования красителей SYBR вместо EtBr для окрашивания, многие исследователи по-прежнему предпочитают EtBr, поскольку он значительно дешевле. [ нужна цитата ]
В большинстве случаев дозировка бромида этидия в лаборатории (0,25–1 мкг/мл) ниже LD50, что делает острую токсичность маловероятной. Для полного понимания долгосрочного риска, который бромид этидия представляет для лабораторных работников, потребуются испытания на людях и более длительные исследования на млекопитающих, но очевидно, что бромид этидия может вызывать мутации в клетках млекопитающих и бактерий. [22]
Бромид этидия не регулируется как опасные отходы при низких концентрациях [23] , но многие организации рассматривают его как опасные отходы. С материалом следует обращаться в соответствии с паспортом безопасности производителя (SDS). [ нужна цитата ]
Утилизация лабораторного бромистого этидия остается спорным вопросом. [24] Бромид этидия можно разложить химическим путем или собрать и сжечь. Отходы бромида этидия, концентрация которых ниже установленной, обычно утилизируются обычным способом (например, сливаются в канализацию). Обычной практикой является обработка бромистого этидия гипохлоритом натрия (отбеливанием) перед утилизацией. [25] Согласно Ланну и Сансону, химическое разложение с использованием отбеливателя приводит к образованию соединений, которые являются мутагенными по тесту Эймса . Данные о мутагенном воздействии продуктов деградации отсутствуют. Ланн и Сансон описывают более эффективные методы деградации. [26] В других случаях рекомендуется удаление бромистого этидия из растворов активированным углем или ионообменной смолой . [27] Для этого использования доступны различные коммерческие продукты. [28]
Трипаносомы в долине реки Гибе на юго-западе Эфиопии продемонстрировали универсальную устойчивость в период с июля 1989 года по февраль 1993 года. [29] Это, вероятно, указывает на необратимую потерю функции в этой области против тестируемой мишени, T. congolense , выделенной из боранского скота . [29]
СМИ, связанные с бромидом этидия, на Викискладе?