stringtranslate.com

Быстрый параллельный протеолиз

FASTpp (Быстрый параллельный протеолиз). Смесь белков аликвотируется в несколько пробирок, которые параллельно подвергаются воздействию различных температур и термостабильной протеазы. Оставшийся белок можно разделить на SDS-PAGE .

Быстрый параллельный протеолиз ( FASTpp ) — это метод определения термостабильности белков путем измерения того , какая фракция белка устойчива к быстрому протеолитическому перевариванию. [1]

История и предыстория

Протеолиз широко используется в биохимии и клеточной биологии для исследования структуры белка . [2] [3] При «ограниченном трипсиновом протеолизе» небольшие количества протеазы расщепляют как свернутый , так и развернутый белок, но с существенно разной скоростью: неструктурированные белки разрезаются быстрее, в то время как структурированные белки разрезаются медленнее (иногда на порядки). Недавно было предложено несколько других анализов стабильности белка, основанных на протеолизу, использующих другие протеазы с высокой специфичностью для расщепления развернутых белков. К ним относятся импульсный протеолиз, [4] протеолитическая сканирующая калориметрия [5] и FASTpp.

Как это работает

FASTpp измеряет количество белка, которое устойчиво к перевариванию в различных условиях. Для этого используется термостабильная протеаза, которая специфически расщепляет открытые гидрофобные остатки. Анализ FASTpp сочетает в себе термическое разворачивание, специфичность термостабильной протеазы для развернутой фракции с разделительной способностью SDS-PAGE . [6] Благодаря этой комбинации FASTpp может обнаруживать изменения во фракции, свернутой в широком физико-химическом диапазоне условий, включая температуры до 85 °C, pH 6–9, наличие или отсутствие всего протеома . Области применения варьируются от биотехнологии до изучения точечных мутаций и анализов связывания лигандов .

Приложения

FASTpp использовался для проверки: [1]

Технологии

Сначала лизат клеток получают путем дробления стеклянных шариков, гомогенизации под давлением или химических или физических методов лизиса, которые не денатурируют интересующий белок (белки). (Необязательно для целевого анализа) интересующий белок очищают из этого лизата с помощью методов аффинности, основанных на внутренне неупорядоченных метках [12] или других подходящих стратегий очистки, часто включающих несколько ортогональных хроматографических этапов.

Этот (общий или очищенный) раствор белка аликвотируется в несколько пробирок ПЦР-стрипа. Все аликвоты подвергаются параллельному воздействию в термоградиентном ПЦР-циклере при различных максимальных температурах в присутствии термостабильной протеазы термолизина (см. рисунок). Автоматический контроль температуры достигается в термоградиентном циклере (обычно используемом для ПЦР ). Продукты реакции могут быть разделены с помощью SDS-PAGE или вестерн-блоттинга . [6] Протеаза термолизин может быть полностью инактивирована ЭДТА . Эта особенность термолизина делает FASTpp совместимым с последующим перевариванием трипсином , например, для масс-спектрометрии . [13] [14] [7]

Ссылки

  1. ^ ab Minde, DP; Maurice, MM; Rüdiger, SGD (2012). Uversky, Vladimir N (ред.). "Определение биофизической стабильности белка в лизатах с помощью быстрого протеолизного анализа, FASTpp". PLOS ONE . ​​7 (10): e46147. Bibcode :2012PLoSO...746147M. doi : 10.1371/journal.pone.0046147 . PMC  3463568 . PMID  23056252.
  2. ^ Джонсон, DE; Сюэ, B.; Сикмейер, MD; Менг, J.; Кортезе, MS; Олдфилд, CJ; Ле Галл, T.; Данкер, AK; Уверски, VN (2012). «Высокопроизводительная характеристика внутреннего беспорядка в белках от Инициативы по структуре белков». Журнал структурной биологии . 180 (1): 201–215. doi :10.1016/j.jsb.2012.05.013. PMC 3578346. PMID  22651963 . 
  3. ^ Hoelen, H.; Kleizen, B.; Schmidt, A.; Richardson, J.; Charitou, P.; Thomas, PJ; Braakman, I. (2010). Uversky, Vladimir N (ред.). "Первичный дефект фолдинга и спасение ΔF508 CFTR возникают во время трансляции мутантного домена". PLOS ONE . ​​5 (11): e15458. Bibcode :2010PLoSO...515458H. doi : 10.1371/journal.pone.0015458 . PMC 2994901 . PMID  21152102. 
  4. ^ Park, C.; Marqusee, S. (2005). «Импульсный протеолиз: простой метод количественного определения стабильности белка и связывания лиганда». Nature Methods . 2 (3): 207–212. doi :10.1038/nmeth740. PMID  15782190. S2CID  21364478.
  5. ^ Тур-Арландис, Г.; Родригес-Ларреа, Д.; Ибарра-Молеро, Б.; Санчес-Руис, ЖМ (2010). «Протеолитическая сканирующая калориметрия: новая методология, исследующая фундаментальные особенности кинетической стабильности белков». Биофизический журнал . 98 (6): Л12–Л14. Бибкод : 2010BpJ....98L..12T. дои : 10.1016/j.bpj.2009.11.028. ПМК 2849053 . ПМИД  20303845. 
  6. ^ ab Laemmli, UK (1970). «Расщепление структурных белков во время сборки головки бактериофага T4». Nature . 227 (5259): 680–685. Bibcode :1970Natur.227..680L. doi :10.1038/227680a0. PMID  5432063. S2CID  3105149.
  7. ^ ab Leuenberger, P; Ganscha, S; Kahraman, A (2017). «Анализ термического разворачивания белка на уровне клеток выявляет детерминанты термостабильности». Science . 355 (6327): eaai7825. doi :10.1126/science.aai7825. PMID  28232526. S2CID  8432125.
  8. ^ Демарест, С. Дж.; Мартинес-Ямут, М.; Чунг, Дж.; Чен, Х.; Сюй, В.; Дайсон, Х. Дж .; Эванс, Р. М.; Райт, П. Э. (2002). «Взаимное синергическое сворачивание при рекрутировании CBP/p300 коактиваторами ядерного рецептора p160». Nature . 415 (6871): 549–553. doi :10.1038/415549a. PMID  11823864. S2CID  4423920.
  9. ^ ab Robaszkiewicz, K.; Ostrowska, Z.; Cyranka-Czaja, A.; Moraczewska, J. (2015). «Нарушенные взаимодействия тропомиозин–тропонин снижают активацию тонкой нити актина». Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Белки и протеомика . 1854 (5): 381–390. doi :10.1016/j.bbapap.2015.01.004. PMID  25603119.
  10. ^ Minde, DP; Anvarian, Z.; Rüdiger, SG; Maurice, MM (2011). «Нарушение порядка: как миссенс-мутации в белке-супрессоре опухолей APC приводят к раку?». Molecular Cancer . 10 : 101. doi : 10.1186/1476-4598-10-101 . PMC 3170638. PMID  21859464 . 
  11. ^ Тур-Арландис, Г.; Родригес-Ларреа, Д.; Ибарра-Молеро, Б.; Санчес-Руис, ЖМ (2010). «Протеолитическая сканирующая калориметрия: новая методология, исследующая фундаментальные особенности кинетической стабильности белков». Биофизический журнал . 98 (6): Л12–Л14. Бибкод : 2010BpJ....98L..12T. дои : 10.1016/j.bpj.2009.11.028. ПМК 2849053 . ПМИД  20303845. 
  12. ^ Minde, DP; Halff, EF; Tans, SJ (2013). «Проектирование беспорядка: Истории о неожиданных хвостах». Внутренне неупорядоченные белки . 1 (1): e26790. doi :10.4161/idp.26790. PMC 5424805. PMID  28516025 . 
  13. ^ Chang, Y; Schlebach, JP; Verheul, RA; Park, C (2012). «Упрощенный протеомный подход к обнаружению взаимодействий белок-лиганд». Protein Science . 21 (9): 1280–7. doi :10.1002/pro.2112. PMC 3631357 . PMID  22733688. 
  14. ^ Park, C; Marqusee, S (2005). «Импульсный протеолиз: простой метод количественного определения стабильности белка и связывания лиганда». Nature Methods . 2 (3): 207–12. doi :10.1038/nmeth740. PMID  15782190. S2CID  21364478.