Эксперимент с одной молекулой — это эксперимент, в котором исследуются свойства отдельных молекул . Исследования одиночных молекул можно противопоставить измерениям ансамбля или объемной коллекции молекул, где невозможно различить индивидуальное поведение молекул и можно измерить только средние характеристики. Поскольку многие методы измерения в биологии, химии и физике недостаточно чувствительны, чтобы наблюдать отдельные молекулы, методы флуоресценции одиночных молекул (появившиеся с 1990-х годов для исследования различных процессов на уровне отдельных молекул) вызвали большое волнение, поскольку они предоставили много новых подробностей об измеряемых процессах, которые были недоступны в прошлом. Действительно, с 1990-х годов было разработано множество методов исследования отдельных молекул. [2]
Первые эксперименты с одиночными молекулами были экспериментами с патч-клампом , проведенными в 1970-х годах, но они ограничивались изучением ионных каналов . Сегодня системы, исследуемые с использованием методов одиночных молекул, включают движение миозина по актиновым нитям в мышечной ткани и спектроскопические детали отдельных локальных сред в твердых телах. Конформации биологических полимеров были измерены с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ). С помощью силовой спектроскопии отдельные молекулы (или пары взаимодействующих молекул), обычно полимеры , можно механически растянуть, а их упругий отклик записать в реальном времени.
В газовой фазе при сверхнизких давлениях эксперименты с одиночными молекулами проводятся уже несколько десятилетий, но в конденсированной фазе только с 1989 года, благодаря работе В. Е. Мёрнера и Лотара Кадора. [3] Год спустя Мишель Оррит и Жаки Бернар смогли также продемонстрировать обнаружение поглощения отдельных молекул по их флуоресценции. [4]
Многие методы позволяют наблюдать одну молекулу за раз, особенно масс-спектрометрия , при которой обнаруживаются отдельные ионы. Кроме того, один из первых способов обнаружения одиночных молекул появился в области ионных каналов с разработкой техники патч-зажима Эрвином Неером и Бертом Сакманном (которые позже получили Нобелевскую премию за свой плодотворный вклад). . Однако идея измерения проводимости для изучения отдельных молекул наложила серьезные ограничения на виды систем, которые можно было наблюдать.
Флуоресценция — удобный способ наблюдения за одной молекулой, главным образом благодаря чувствительности коммерческих оптических детекторов, способных считать отдельные фотоны. Однако спектроскопически наблюдение одной молекулы требует, чтобы молекула находилась в изолированной среде и излучала фотоны при возбуждении, что благодаря технологии обнаружения одиночных фотонов с использованием фотоумножителей (ФЭУ) или лавинных фотодиодов (ЛФД), позволяет регистрировать события эмиссии фотонов с высокой чувствительностью и временным разрешением.
В последнее время флуоресценция одиночных молекул стала предметом повышенного интереса для биологической визуализации посредством мечения биомолекул, таких как белки и нуклеотиды, для изучения ферментативной функции, которую нелегко изучить в массовом масштабе из-за тонких зависящих от времени движений в катализе. и структурная реорганизация. Наиболее изученным белком является класс ферментов миозина/актина, обнаруженных в мышечных тканях. С помощью методов одиночных молекул ступенчатый механизм был обнаружен и охарактеризован во многих из этих белков.
В 1997 году обнаружение одиночных молекул было продемонстрировано с помощью рамановской спектроскопии с поверхностным усилением (SERS) Катрин Кнайпп , Х. Кнейпп, Ю. Ванг, Л.Т. Перельман и другие [5] в Массачусетском технологическом институте и независимо С. Ни и С.Р. Эмори в Индиане. Университет . [6] Команда Массачусетского технологического института использовала нерезонансное комбинационное возбуждение и усиление поверхности с помощью нанокластеров серебра для обнаружения одиночных молекул крезилового фиолетового , в то время как команда из Университета Индианы использовала резонансное комбинационное возбуждение и усиление поверхности с помощью наночастиц серебра для обнаружения одиночных молекул родамина 6G .
Наноманипуляторы, такие как атомно-силовой микроскоп, также подходят для биологически значимых экспериментов с одиночными молекулами, поскольку они работают в том же масштабе длины, что и большинство биологических полимеров. Кроме того, атомно-силовая микроскопия (АСМ) пригодна для исследования молекул синтетических полимеров. АСМ предоставляет уникальную возможность 3D-визуализации полимерных цепей. Например, режим постукивания АСМ достаточно мягок для регистрации адсорбированных молекул полиэлектролита (например, цепочек поли(2-винилпиридина) толщиной 0,4 нм) в жидкой среде. В этих экспериментах местоположение двухцепочечной суперпозиции соответствует двойной толщине одиночной цепи (0,8 нм в случае упомянутого примера). При использовании правильных параметров сканирования конформация таких молекул остается неизменной в течение нескольких часов, что позволяет проводить эксперименты в жидких средах с различными свойствами. [1] Кроме того, контролируя силу между наконечником и образцом, можно получить изображения с высоким разрешением. [7] [8] Оптические пинцеты также использовались для изучения и количественной оценки взаимодействий ДНК-белок. [7] [8]
Флуоресцентная спектроскопия одиночных молекул использует флуоресценцию молекулы для получения информации о ее окружении, структуре и положении. Этот метод дает возможность получать информацию, которая иначе не была бы доступна из-за усреднения по ансамблю (т. е. сигнал, полученный при одновременной регистрации множества молекул, представляет собой среднее свойство динамики молекул). Результаты многих экспериментов с отдельными молекулами представляют собой траектории с двумя состояниями .
Как и в случае флуоресцентной спектроскопии одиночных молекул, метод, известный как одноканальная запись, может использоваться для получения конкретной кинетической информации (в данном случае о функции ионного канала), которая недоступна, когда используется ансамблевая запись, например запись всей клетки. выполненный. [9] В частности, ионные каналы чередуются между проводящими и непроводящими классами, которые различаются конформацией. Таким образом, функциональное состояние ионных каналов можно напрямую измерить с помощью достаточно чувствительной электроники при условии принятия надлежащих мер предосторожности для минимизации шума. В свою очередь, каждый из этих классов можно разделить на одно или несколько кинетических состояний, имеющих прямое отношение к основной функции ионного канала. Выполнение этих типов исследований одиночных молекул в систематически изменяющихся условиях (например, концентрация и структура агониста, блокатор проникающих ионов и/или каналов, мутации в аминокислотах ионного канала) может предоставить информацию о взаимном преобразовании различных кинетических состояний ионного канала. [10] В минимальной модели ионного канала существует два состояния : открытое и закрытое. Однако для точного представления данных часто необходимы другие состояния, включая множественные закрытые состояния, а также неактивные и/или десенсибилизированные состояния, которые представляют собой непроводящие состояния, которые могут возникнуть даже в присутствии стимула. [9]
Отдельные флуорофоры можно химически прикрепить к биомолекулам, таким как белки или ДНК, а динамику отдельных молекул можно отслеживать, контролируя флуоресцентный зонд. Можно отслеживать пространственные перемещения в пределах предела Рэлея , а также изменения интенсивности излучения и/или радиационного времени жизни, которые часто указывают на изменения в местной окружающей среде. Например, мечение одиночных молекул дало огромное количество информации о том, как моторные белки кинезина перемещаются по нитям микротрубочек в мышечных клетках. Визуализация одиночных молекул в живых клетках дает интересную информацию о динамике белка в его физиологическом окружении. Некоторые биофизические параметры динамики белка могут быть определены количественно, такие как коэффициент диффузии, среднеквадратичные смещения, время пребывания, доля связанных и несвязанных молекул, а также механизм поиска цели связывания белка с его целевым сайтом в живой клетке. [11]
Основная статья smFRET .
При резонансном переносе энергии флуоресценции одиночной молекулы молекула помечена (по крайней мере) в двух местах. Лазерный луч фокусируется на молекуле, возбуждающей первый зонд. Когда этот зонд расслабляется и испускает фотон, у него появляется шанс возбудить другой зонд. Эффективность поглощения фотона, испущенного из первого зонда, во втором зонде зависит от расстояния между этими зондами. Поскольку расстояние меняется со временем, этот эксперимент исследует внутреннюю динамику молекулы.
При рассмотрении данных, относящихся к отдельным молекулам, обычно можно построить пропагаторы и функции плотности вероятности скачка времени первого порядка, второго порядка и т. д., тогда как в объемных экспериментах обычно получают затухание корреляционной функции. [12] Из информации, содержащейся в этих уникальных функциях (полученных из отдельных молекул), можно получить относительно четкую картину поведения системы; например, его кинетическая схема , или его потенциал активности, или его уменьшенные размеры . [13] [14] В частности, можно построить (многие свойства) путь реакции фермента при мониторинге активности отдельного фермента. [15] Кроме того, несколько авторов описали важные аспекты анализа данных об отдельных молекулах, такие как методы подбора и тесты для однородных популяций. [9] С другой стороны, существует несколько проблем с анализом данных об отдельных молекулах, включая создание среды с низким уровнем шума и изолированных наконечников пипеток, фильтрацию некоторых оставшихся нежелательных компонентов (шума), обнаруженных в записях, а также продолжительность времени необходимые для анализа данных (предварительная обработка, однозначное обнаружение событий, построение графиков данных, подгонка кинетических схем и т. д.).
Методы одиночных молекул повлияли на оптику, электронику, биологию и химию. В биологических науках изучение белков и других сложных биологических механизмов ограничивалось ансамблевыми экспериментами, которые практически делали невозможным прямое наблюдение их кинетики. Например, только после того, как флуоресцентная микроскопия одиночных молекул была использована для изучения пар кинезин-миозин в мышечной ткани, стало понятно прямое наблюдение за механизмами ходьбы. Однако эти эксперименты по большей части ограничивались исследованиями in vitro, поскольку полезные методы визуализации живых клеток еще не полностью реализованы. Однако перспектива визуализации одиночных молекул in vivo [16] несет в себе огромный потенциал для непосредственного наблюдения биомолекул в нативных процессах. Эти методы часто нацелены на исследования белков с низким содержанием копий, многие из которых все еще обнаруживаются. Эти методы также были распространены на изучение областей химии, включая картирование гетерогенных поверхностей. [17]