stringtranslate.com

Спектроскопия силы

Силовая спектроскопия представляет собой набор методов для изучения взаимодействий и сил связи между отдельными молекулами. [1] [2] Эти методы могут быть использованы для измерения механических свойств отдельных полимерных молекул или белков , или отдельных химических связей . Название «силовая спектроскопия », хотя и широко используется в научном сообществе, несколько вводит в заблуждение, поскольку нет настоящего взаимодействия материи и излучения. [3]

Методы, которые можно использовать для проведения силовой спектроскопии, включают атомно-силовую микроскопию , [2] оптический пинцет , [4] магнитный пинцет , акустическую силовую спектроскопию, [5] микроиглы, [6] и биомембраны. [7]

Силовая спектроскопия измеряет поведение молекулы под действием механической силы растяжения или кручения . Таким образом, в последние годы было изучено много о механохимической связи в ферментах, ответственных за сокращение мышц , транспорт в клетке , генерацию энергии (F1-АТФаза), репликацию и транскрипцию ДНК (полимеразы), распутывание и разматывание ДНК (топоизомеразы и геликазы). [8]

Как метод одиночной молекулы , в отличие от типичных ансамблевых спектроскопий, он позволяет исследователю определять свойства конкретной изучаемой молекулы. В частности, могут наблюдаться редкие события, такие как конформационные изменения, которые замаскированы в ансамбле.

Экспериментальные методы

Существует множество способов точной манипуляции отдельными молекулами. Наиболее заметными среди них являются оптические или магнитные пинцеты, кантилеверы атомно-силового микроскопа (АСМ) и акустическая силовая спектроскопия. Во всех этих методах биомолекула, такая как белок или ДНК, или какой-либо другой биополимер, имеет один конец, связанный с поверхностью или микрометрическим размером бусины, а другой - с датчиком силы. Датчик силы обычно представляет собой микрометрический размер бусины или кантилевера, смещение которого можно измерить для определения силы.

Кантилеверы атомно-силового микроскопа

Молекулы, адсорбированные на поверхности , подхватываются микроскопическим наконечником (шириной в нанометры), который расположен на конце эластичного кантилевера. В более сложной версии этого эксперимента (химическая силовая микроскопия) наконечники ковалентно функционализируются с интересующими молекулами. [9] Затем пьезоэлектрический контроллер подтягивает кантилевер. Если на эластичный кантилевер действует некоторая сила (например, потому что некоторая молекула растягивается между поверхностью и наконечником), он отклонится вверх (сила отталкивания) или вниз (сила притяжения). Согласно закону Гука , это отклонение будет пропорционально силе, действующей на кантилевер. Отклонение измеряется по положению лазерного луча, отраженного кантилевером. Такой тип установки может измерять силы вплоть до 10 пН (10−11 Н ) , фундаментальный предел разрешения определяется тепловым шумом кантилевера .

Так называемая кривая силы представляет собой график силы (или, точнее, отклонения кантилевера) в зависимости от пьезоэлектрического положения на оси Z. Идеальная пружина Гука , например, будет отображать прямую диагональную кривую силы. Обычно кривые силы, наблюдаемые в экспериментах по силовой спектроскопии, состоят из контактной (диагональной) области, где зонд контактирует с поверхностью образца, и бесконтактной области, где зонд находится вне поверхности образца. Когда восстанавливающая сила кантилевера превышает силу адгезии наконечника к образцу, зонд выскакивает из контакта, и величина этого скачка часто используется в качестве меры силы адгезии или силы разрыва. В общем случае разрыв связи наконечника с поверхностью является стохастическим процессом; поэтому для надежной количественной оценки силы адгезии требуется получение нескольких отдельных кривых силы. Гистограмма сил адгезии, полученных в этих множественных измерениях, обеспечивает основные выходные данные для измерения силовой спектроскопии.

В биофизике силовая спектроскопия одиночных молекул может использоваться для изучения энергетического ландшафта, лежащего в основе взаимодействия двух биомолекул, таких как белки. Здесь один связывающий партнер может быть прикреплен к кончику кантилевера с помощью гибкой линкерной молекулы (цепь ПЭГ), в то время как другой иммобилизован на поверхности подложки. При типичном подходе кантилевер многократно приближается и отводится от образца с постоянной скоростью. В некоторых случаях будет происходить связывание между двумя партнерами, что станет видно на силовой кривой, поскольку использование гибкого линкера приводит к характерной форме кривой (см. Модель червеобразной цепи ), отличной от адгезии. Собранные силы разрыва затем можно проанализировать как функцию скорости нагрузки связи. Полученный график средней силы разрыва как функции скорости нагрузки называется спектром силы и образует базовый набор данных для динамической силовой спектроскопии . [10] [11]

В идеальном случае одного острого энергетического барьера для взаимодействия наконечника с образцом динамический спектр силы будет показывать линейное увеличение силы разрыва как функции логарифма скорости нагрузки, как описано в модели, предложенной Беллом и др. [12] Здесь наклон спектра силы разрыва равен , где - расстояние от минимума энергии до переходного состояния . До сих пор существует ряд теоретических моделей, описывающих связь между скоростью нагрузки и силой разрыва, основанных на различных предположениях и предсказывающих различные формы кривых. [11] [13]

Например, Ма X., Госай А. и др. использовали динамическую силовую спектроскопию вместе с моделированием молекулярной динамики, чтобы выяснить силу связи между тромбином, белком свертывания крови, и его ДНК-аптамером. [14]

Акустическая силовая спектроскопия

Недавно разработанная технология, акустическая силовая спектроскопия (AFS), позволяет осуществлять силовую манипуляцию сотнями отдельных молекул и отдельных клеток параллельно, обеспечивая высокую экспериментальную производительность. [5] В этой технологии пьезоэлемент резонансно возбуждает плоские акустические волны над микрофлюидным чипом. Сгенерированные акустические волны способны оказывать силы на микросферы с плотностью, отличной от плотности окружающей среды. Биомолекулы, такие как ДНК, РНК или белки, могут быть индивидуально привязаны между микросферами и поверхностью, а затем зондироваться акустическими силами, оказываемыми пьезодатчиком. С помощью устройств AFS можно прикладывать силы в диапазоне от 0 до нескольких сотен пиконьютонов к сотням микросфер и получать кривые силы-расширения или гистограммы сил разрыва многих отдельных событий параллельно.

Этот метод в основном используется для изучения ДНК-связывающих белков. Например, AFS использовался для изучения бактериальной транскрипции в присутствии антибактериальных агентов. [15] Вирусные белки также могут быть изучены с помощью AFS, например, этот метод использовался для изучения уплотнения ДНК наряду с другими подходами с использованием одной молекулы. [16]

Ячейками также можно манипулировать с помощью акустических сил напрямую или с помощью микросфер в качестве ручек. [17]

Оптический пинцет

Другой метод, который набирает популярность в экспериментах с отдельными молекулами, — это использование оптического пинцета для приложения механических сил к молекулам. Сильно сфокусированный лазерный луч способен захватывать и удерживать частицы (диэлектрического материала) в диапазоне размеров от нанометров до микрометров. Захватывающее действие оптического пинцета обусловлено дипольной или оптической градиентной силой на диэлектрической сфере. Метод использования сфокусированного лазерного луча в качестве ловушки для атомов был впервые применен в 1984 году в лабораториях Белла. До этого эксперименты проводились с использованием противоположно направленных лазеров в качестве средства для захвата частиц. Более поздние эксперименты в том же проекте в лабораториях Белла и других с тех пор показали безвредную манипуляцию клетками с использованием инфракрасного лазера. Таким образом, была заложена основа для биологических экспериментов с оптическим захватом.

У каждой методики есть свои преимущества и недостатки. Например, кантилеверы АСМ могут измерять ангстремные масштабы, миллисекундные события и силы, превышающие 10 пН. Хотя стеклянные микроволокна не могут достичь такого точного пространственного и временного разрешения, они могут измерять пиконьютоновые силы. Оптические пинцеты позволяют измерять пиконьютоновые силы и нанометровые смещения, что является идеальным диапазоном для многих биологических экспериментов. Магнитные пинцеты могут измерять фемтоньютоновые силы, и, кроме того, их также можно использовать для приложения кручения. Устройства AFS позволяют проводить статистический анализ механических свойств биологических систем, прикладывая пиконьютоновые силы к сотням отдельных частиц параллельно, со временем отклика менее миллисекунды.

Приложения

Распространенными применениями силовой спектроскопии являются измерения эластичности полимеров , особенно биополимеров, таких как РНК и ДНК . [18] Другое биофизическое применение силовой спектроскопии полимеров — это разворачивание белков . [19] Модульные белки могут быть адсорбированы на поверхности золота или (реже) слюды , а затем растянуты. Последовательное разворачивание модулей наблюдается как очень характерный пилообразный рисунок на графике силы и удлинения; каждый зубец соответствует разворачиванию одного белкового модуля (за исключением последнего, который обычно представляет собой отрыв молекулы белка от кончика). С помощью этой техники можно получить много информации об эластичности белков и разворачивании белков. Многие белки в живой клетке должны сталкиваться с механическим напряжением.

Более того, силовая спектроскопия может быть использована для исследования ферментативной активности белков, участвующих в репликации ДНК , транскрипции , организации и репарации . Это достигается путем измерения положения шарика, прикрепленного к комплексу ДНК-белок, остановленному на ДНК-связке, один конец которой прикреплен к поверхности, при сохранении постоянной силы. Этот метод использовался, например, для изучения ингибирования удлинения транскрипции клебсидином и ацинетодином. [20]

Другим основным применением силовой спектроскопии является изучение механического сопротивления химических связей. В этом случае, как правило, наконечник функционализируется лигандом, который связывается с другой молекулой, связанной с поверхностью. Наконечник прижимается к поверхности, обеспечивая контакт между двумя молекулами, а затем отводится до тех пор, пока вновь образованная связь не разорвется. Измеряется сила, при которой разрывается связь. Поскольку механический разрыв является кинетическим, стохастическим процессом , разрывная сила не является абсолютным параметром, но она является функцией как температуры, так и скорости вытягивания. Низкие температуры и высокие скорости вытягивания соответствуют более высоким разрывным силам. Путем тщательного анализа разрывной силы при различных скоростях вытягивания можно составить карту энергетического ландшафта химической связи под действием механической силы. [21] Это приводит к интересным результатам в изучении взаимодействия антитело - антиген , белок-белок, белок-живая клетка и связей захвата . [22]

Недавно эта техника была использована в клеточной биологии для измерения агрегированных стохастических сил, создаваемых моторными белками , которые влияют на движение частиц внутри цитоплазмы. Таким образом, микроскопия спектра силы может быть использована для лучшего понимания многих клеточных процессов, требующих движения частиц внутри цитоплазмы. [23]

Ссылки

  1. ^ Neuman KC, Nagy A (июнь 2008 г.). «Силовая спектроскопия одиночных молекул: оптические пинцеты, магнитные пинцеты и атомно-силовая микроскопия». Nature Methods . 5 (6): 491–505. doi :10.1038/nmeth.1218. PMC  3397402 . PMID  18511917.
  2. ^ ab Hoffmann T, Dougan L (июль 2012 г.). «Силовая спектроскопия одиночных молекул с использованием полипротеинов». Chemical Society Reviews . 41 (14): 4781–4796. doi :10.1039/c2cs35033e. PMID  22648310.
  3. ^ Bizzarri AR, Cannistraro S (25 января 2012 г.). Динамическая силовая спектроскопия и биомолекулярное распознавание. CRC Press . стр. 1–. ISBN 978-1-4398-6237-7.
  4. ^ Jagannathan B, Marqusee S (ноябрь 2013 г.). «Сворачивание и разворачивание белков под действием силы». Biopolymers . 99 (11): 860–869. doi :10.1002/bip.22321. PMC 4065244 . PMID  23784721. 
  5. ^ ab Sitters G, Kamsma D, Thalhammer G, Ritsch-Marte M, Peterman EJ, Wuite GJ (январь 2015 г.). "Акустическая силовая спектроскопия". Nature Methods . 12 (1): 47–50. doi :10.1038/nmeth.3183. PMID  25419961. S2CID  12886472.
  6. ^ Кишино А, Янагида Т (июль 1988). «Измерения силы путем микроманипуляций одиночной актиновой нити стеклянными иглами». Nature . 334 (6177): 74–76. Bibcode :1988Natur.334...74K. doi :10.1038/334074a0. PMID  3386748. S2CID  4274023.
  7. ^ Эванс Э., Ричи К., Меркель Р. (июнь 1995 г.). «Метод чувствительной силы для исследования молекулярной адгезии и структурных связей на биологических интерфейсах». Biophysical Journal . 68 (6): 2580–2587. Bibcode :1995BpJ....68.2580E. doi :10.1016/S0006-3495(95)80441-8. PMC 1282168 . PMID  7647261. 
  8. ^ Mohapatra S, Lin CT, Feng XA, Basu A, Ha T (январь 2020 г.). «Анализ отдельных молекул и проектирование двигателей ДНК». Chemical Reviews . 120 (1): 36–78. doi :10.1021/acs.chemrev.9b00361. PMID  31661246. S2CID  204974046.
  9. ^ Отт В., Джобст МА, Шолер К., Гауб Х.Е., Нэш МА (январь 2017 г.). «Силовая спектроскопия одиночных молекул на полипротеинах и комплексах рецептор-лиганд: текущий набор инструментов». Журнал структурной биологии . 197 (1): 3–12. doi :10.1016/j.jsb.2016.02.011. PMID  26873782.
  10. ^ Бхушан Б (2017). Справочник Springer по нанотехнологиям . ISBN 9783662543573. OCLC  1012104482.[ нужна страница ]
  11. ^ аб Хинтердорфер П., Ван Ойен А (2009). Справочник по биофизике одиночных молекул . Спрингер. ISBN 9780387764979. OCLC  534951120.[ нужна страница ]
  12. ^ Bell GI (май 1978). «Модели специфической адгезии клеток к клеткам». Science . 200 (4342): 618–627. Bibcode :1978Sci...200..618B. doi :10.1126/science.347575. PMID  347575.
  13. ^ Петросян Р. (2020). «Определение силы разворачивания и унифицированная модель зависимости средней силы разворачивания от скорости нагружения». J. Stat. Mech . 2020 (33201): 033201. arXiv : 1904.03925 . Bibcode : 2020JSMTE..03.3201P. doi : 10.1088/1742-5468/ab6a05 .
  14. ^ Ma X, Gosai A, Balasubramanian G, Shrotriya P (май 2019 г.). «Силовая спектроскопия взаимодействия тромбина с аптамером: сравнение экспериментов АСМ и моделирования молекулярной динамики». Applied Surface Science . 475 : 462–472. Bibcode :2019ApSS..475..462M. doi :10.1016/j.apsusc.2019.01.004. S2CID  104310868.
  15. ^ Метелев М, Арсеньев А, Бушин ЛБ, Кузнеделов К, Артамонова ТО, Кондратенко Р и др. (март 2017 г.). «Ацинетодин и клебсидин, РНК-полимераза, нацеливающая лассо-пептиды, продуцируемые человеческими изолятами Acinetobacter gyllenbergii и Klebsiella pneumoniae». ACS Chemical Biology . 12 (3): 814–824. doi :10.1021/acschembio.6b01154. PMID  28106375.
  16. ^ Marchetti M, Kamsma D, Cazares Vargas E, Hernandez García A, van der Schoot P, de Vries R и др. (август 2019 г.). «Сборка вирусоподобных нуклеокапсидов в реальном времени, выявленная на уровне отдельных частиц». Nano Letters . 19 (8): 5746–5753. doi :10.1021/acs.nanolett.9b02376. PMC 6696885 . PMID  31368710. 
  17. ^ Соркин Р., Бергамаски Г., Камсма Д., Бранд Г., Декель Э., Офир-Бирин Ю. и др. (август 2018 г.). «Исследование клеточной механики с помощью акустической силовой спектроскопии». Молекулярная биология клетки . 29 (16): 2005–2011. doi :10.1091/mbc.E18-03-0154. ПМК 6232971 . ПМИД  29927358. 
  18. ^ Williams MC, Rouzina I (июнь 2002 г.). «Силовая спектроскопия отдельных молекул ДНК и РНК». Current Opinion in Structural Biology . 12 (3): 330–336. doi :10.1016/S0959-440X(02)00340-8. PMID  12127451.
  19. ^ Jagannathan B, Elms PJ, Bustamante C, Marqusee S (октябрь 2012 г.). «Прямое наблюдение силового переключения в анизотропном механическом пути разворачивания белка». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 109 (44): 17820–17825. Bibcode : 2012PNAS..10917820J. doi : 10.1073/pnas.1201800109 . PMC 3497811. PMID  22949695 . 
  20. ^ Метелев М, Арсеньев А, Бушин ЛБ, Кузнеделов К, Артамонова ТО, Кондратенко Р и др. (март 2017 г.). «Ацинетодин и клебсидин, РНК-полимераза, нацеливающая лассо-пептиды, продуцируемые человеческими изолятами Acinetobacter gyllenbergii и Klebsiella pneumoniae». ACS Chemical Biology . 12 (3): 814–824. doi :10.1021/acschembio.6b01154. PMID  28106375.
  21. ^ Merkel R, Nassoy P, Leung A, Ritchie K, Evans E (январь 1999). «Энергетические ландшафты связей рецептор-лиганд, исследованные с помощью динамической силовой спектроскопии». Nature . 397 (6714): 50–53. Bibcode :1999Natur.397...50M. doi :10.1038/16219. PMID  9892352. S2CID  4419330.
  22. ^ Schoeler C, Malinowska KH, Bernardi RC, Milles LF, Jobst MA, Durner E и др. (декабрь 2014 г.). «Ультрастабильный комплекс адгезии целлюлосомы стягивается под нагрузкой». Nature Communications . 5 (1): 5635. Bibcode :2014NatCo...5.5635S. doi :10.1038/ncomms6635. PMC 4266597 . PMID  25482395. 
  23. ^ Guo M, Ehrlicher AJ, Jensen MH, Renz M, Moore JR, Goldman RD и др. (август 2014 г.). «Исследование стохастических, моторных свойств цитоплазмы с использованием микроскопии силового спектра». Cell . 158 (4): 822–832. doi :10.1016/j.cell.2014.06.051. PMC 4183065 . PMID  25126787. 

Дальнейшее чтение