В молекулярном клонировании и биологии , нокаут гена (сокращенно: KI ) относится к методу генной инженерии , который включает в себя замену информации о последовательности ДНК один к одному в генетическом локусе или вставку информации о последовательности, не найденной в локусе. [1] Обычно это делается на мышах, поскольку технология для этого процесса более совершенна, и существует высокая степень общей сложности последовательностей между мышами и людьми. [2] Разница между технологией нокаута и традиционными трансгенными методами заключается в том, что нокаут включает в себя ген, вставленный в определенный локус, и, таким образом, является «целевой» вставкой. Это противоположность нокауту гена .
Распространенное применение технологии knock-in — создание моделей заболеваний. Это метод, с помощью которого ученые-исследователи могут изучать функцию регуляторного аппарата (например, промоутеров ), который управляет экспрессией естественного гена, который заменяется. Это достигается путем наблюдения за новым фенотипом рассматриваемого организма. В этом случае используются BAC и YAC, чтобы можно было переносить большие фрагменты.
Нок-ин гена возник как небольшая модификация оригинальной техники нокаута, разработанной Мартином Эвансом , Оливером Смитисом и Марио Капеччи . Традиционно, техники нокаута основывались на гомологичной рекомбинации для управления целевой заменой гена, хотя были разработаны и другие методы, использующие транспозон -опосредованную систему для вставки целевого гена. [3] Примером этого является использование фланкирующих участков loxP , которые вырезаются при экспрессии рекомбиназы Cre с генными векторами. Затем эмбриональные стволовые клетки с интересующей модификацией имплантируются в жизнеспособную бластоцисту , которая вырастет в зрелую химерную мышь, некоторые клетки которой будут иметь исходную генетическую информацию бластоцисты, а другие клетки будут иметь модификации, введенные в эмбриональные стволовые клетки. Последующее потомство химерной мыши будет иметь нок-ин гена. [4]
Вставка гена впервые позволила проводить основанные на гипотезах исследования генных модификаций и полученных фенотипов. Мутации в гене человека p53 , например, могут быть вызваны воздействием бензо(а)пирена (BaP), а мутировавшая копия гена p53 может быть вставлена в геномы мышей. Опухоли легких, наблюдаемые у мышей, подвергшихся вставке, подтверждают гипотезу о канцерогенности BaP . [5] Более поздние разработки в технике вставки гена позволили свиньям вставить ген зеленого флуоресцентного белка с помощью системы CRISPR/Cas9 , что позволяет осуществлять гораздо более точные и успешные вставки генов. [6] Скорость вставки гена, опосредованной CRISPR/Cas9, также позволяет генерировать биаллельные модификации некоторых генов и наблюдать фенотип у мышей в течение одного поколения, что является беспрецедентным временным интервалом. [7]
Технология нокаута отличается от технологии нокаута тем, что технология нокаута направлена либо на удаление части последовательности ДНК, либо на вставку нерелевантной информации о последовательности ДНК для нарушения экспрессии определенного генетического локуса. Технология нокаута гена, с другой стороны, изменяет интересующий генетический локус посредством замены информации о последовательности ДНК один к одному или путем добавления информации о последовательности, которая не найдена в указанном генетическом локусе. Поэтому нокаут гена можно рассматривать как мутацию приобретения функции , а нокаут гена — как мутацию потери функции , но нокаут гена может также включать замену функционального локуса гена на мутантный фенотип, что приводит к некоторой потере функции. [8]
Благодаря успеху методов генного нокауна на сегодняшний день можно представить множество клинических приложений. Нок-ин участков гена человеческого иммуноглобулина в мышей уже показал, что позволяет им производить гуманизированные антитела, которые являются терапевтически полезными. [9] Должно быть возможным модифицировать стволовые клетки у людей для восстановления целевой функции гена в определенных тканях, например, возможно, исправить мутантный ген гамма-цепи рецептора IL-2 в гемопоэтических стволовых клетках для восстановления развития лимфоцитов у людей с тяжелым комбинированным иммунодефицитом , сцепленным с Х-хромосомой . [4]
Хотя технология вставки генов оказалась мощным методом для создания моделей человеческих заболеваний и понимания белков in vivo , все еще существуют многочисленные ограничения. Многие из них являются общими с ограничениями технологии нокаута. Во-первых, комбинации вставок генов приводят к растущей сложности взаимодействий, которые вставленные гены и их продукты имеют с другими участками генома, и, следовательно, могут привести к большему количеству побочных эффектов и труднообъяснимым фенотипам . Кроме того, только несколько локусов, таких как локус ROSA26, были охарактеризованы достаточно хорошо, чтобы их можно было использовать для условных вставок генов; что делает комбинации репортерных и трансгенов в одном и том же локусе проблематичными. Самым большим недостатком использования вставки генов для создания моделей человеческих заболеваний является то, что физиология мышей не идентична физиологии людей, и человеческие ортологи белков, экспрессируемых у мышей, часто не будут полностью отражать роль гена в патологии человека. [10] Это можно увидеть у мышей, полученных с мутацией фиброза ΔF508 в гене CFTR , которая составляет более 70% мутаций в этом гене для человеческой популяции и приводит к кистозному фиброзу . Хотя мыши ΔF508 CF действительно демонстрируют дефекты обработки, характерные для человеческой мутации, они не демонстрируют легочные патофизиологические изменения, наблюдаемые у людей, и практически не имеют легочного фенотипа. [11] Такие проблемы могут быть улучшены с помощью использования различных животных моделей, и свиные модели (свиные легкие имеют много биохимических и физиологических сходств с человеческими легкими) были созданы в попытке лучше объяснить активность мутации ΔF508. [12]