Высокопроизводительный скрининг ( HTS ) — это метод научных открытий, который особенно используется при разработке лекарств и имеет отношение к областям биологии , материаловедения [1] и химии . [2] [3] Используя робототехнику , программное обеспечение для обработки/управления данными, устройства для работы с жидкостями и чувствительные детекторы, высокопроизводительный скрининг позволяет исследователю быстро проводить миллионы химических, генетических или фармакологических тестов. Благодаря этому процессу можно быстро распознать активные соединения, антитела или гены, которые модулируют определенный биомолекулярный путь. Результаты этих экспериментов дают отправную точку для разработки лекарств и для понимания невзаимодействия или роли конкретного места.
Ключевым лабораторным оборудованием или испытательным сосудом для HTS является микротитровальный планшет , который представляет собой небольшой контейнер, обычно одноразовый, изготовленный из пластика, который имеет сетку из небольших открытых ячеек, называемых лунками . Обычно микропланшеты для ВТС имеют 96, 192, 384, 1536, 3456 или 6144 лунок. Все эти числа кратны 96, что отражает исходный 96-луночный микропланшет с расположенными между собой лунками 8 x 12 с расстоянием между ними 9 мм. Большинство лунок содержат тестовые объекты, в зависимости от характера эксперимента. Это могут быть различные химические соединения, растворенные, например, в водном растворе диметилсульфоксида (ДМСО). Лунки также могут содержать клетки или ферменты того или иного типа. (Другие лунки могут быть пустыми или содержать чистый растворитель или необработанные образцы, предназначенные для использования в качестве экспериментального контроля .)
В центре скрининга обычно имеется библиотека стандартных пластинок , содержимое которых тщательно каталогизировано, каждая из которых может быть создана в лаборатории или получена из коммерческого источника. Сами эти исходные пластины непосредственно в экспериментах не используются; вместо этого по мере необходимости создаются отдельные планшеты для анализа . Аналитический планшет — это просто копия маточного планшета, созданная путем перекачивания небольшого количества жидкости (часто измеряемого в нанолитрах ) из лунок маточного планшета в соответствующие лунки полностью пустого планшета.
Чтобы подготовиться к анализу , исследователь заполняет каждую лунку планшета каким-либо биологическим объектом, с которым он хочет провести эксперимент, например белком , клетками или эмбрионом животного . По прошествии некоторого времени инкубации, позволяющего биологическому веществу абсорбироваться, связываться или иным образом реагировать (или не реагировать) с соединениями в лунках, измерения проводятся во всех лунках планшета вручную или с помощью машины. Ручные измерения часто необходимы, когда исследователь использует микроскопию , например, для поиска изменений или дефектов в эмбриональном развитии, вызванных соединениями лунок, в поисках эффектов, которые компьютер не может легко определить сам по себе. В противном случае специализированная автоматизированная аналитическая машина может провести ряд экспериментов с лунками (например, осветить их поляризованным светом и измерить отражательную способность, которая может указывать на связывание белка). В этом случае машина выводит результат каждого эксперимента в виде сетки числовых значений, где каждое число соответствует значению, полученному из одной лунки. Высокопроизводительная аналитическая машина может измерить десятки пластин за несколько минут, очень быстро генерируя тысячи экспериментальных данных.
В зависимости от результатов этого первого анализа исследователь может выполнить последующие анализы в рамках того же скрининга, «отбирая» жидкость из исходных лунок, которая дала интересные результаты (известные как «попадания»), в новые планшеты для анализа, а затем повторно прогоняя эксперимент по сбору дополнительных данных об этом суженном наборе, подтверждающих и уточняющих наблюдения.
Автоматизация является важным элементом полезности HTS. Обычно интегрированная роботизированная система , состоящая из одного или нескольких роботов, транспортирует аналитические микропланшеты от станции к станции для добавления проб и реагентов, смешивания, инкубации и, наконец, считывания или обнаружения. Система HTS обычно может готовить, инкубировать и анализировать множество планшетов одновременно, что еще больше ускоряет процесс сбора данных. В настоящее время существуют роботы HTS, которые могут тестировать до 100 000 соединений в день. [4] [5] Автоматические сборщики колоний отбирают тысячи микробных колоний для высокопроизводительного генетического скрининга. [6] Термин uHTS или сверхвысокопроизводительный скрининг относится (около 2008 г.) к скринингу более 100 000 соединений в день. [7]
Благодаря возможности быстрого скрининга различных соединений (таких как малые молекулы или миРНК ) для идентификации активных соединений, HTS привел к взрывному росту количества данных, генерируемых в последние годы. [8] Следовательно, одной из наиболее фундаментальных задач в экспериментах HTS является извлечение биохимической значимости из множества данных, что зависит от разработки и принятия соответствующих экспериментальных планов и аналитических методов как для контроля качества, так и для отбора совпадений. [9] Исследования HTS — одна из областей, особенность которой описана Джоном Блюмом, главным научным сотрудником компании Applied Proteomics, Inc., следующим образом: вскоре, если учёный не разбирается в какой-либо статистике или элементарных технологиях обработки данных, он или она может не считаться настоящим молекулярным биологом и, таким образом, просто станет «динозавром». [10]
Высококачественные анализы HTS имеют решающее значение в экспериментах HTS. Разработка высококачественных анализов HTS требует интеграции как экспериментальных, так и вычислительных подходов к контролю качества (КК). Тремя важными средствами контроля качества являются (i) хорошая конструкция планшета, (ii) выбор эффективных положительных и отрицательных химических/биологических контролей и (iii) разработка эффективных показателей контроля качества для измерения степени дифференциации, чтобы анализы с плохими данными качество можно определить.[11] Хорошая конструкция пластины помогает выявить систематические ошибки (особенно те, которые связаны с положением скважины) и определить, какую нормализацию следует использовать для устранения/уменьшения влияния систематических ошибок как на контроль качества, так и на выбор совпадений. [9]
Эффективные аналитические методы контроля качества служат гарантией превосходного качества анализов. В типичном эксперименте HTS четкое различие между положительным контролем и отрицательным эталоном, например отрицательным контролем, является показателем хорошего качества. Было предложено множество мер оценки качества для измерения степени дифференциации между положительным контролем и отрицательным эталоном. Отношение сигнал/фон, отношение сигнал/шум, окно сигнала, коэффициент вариабельности анализа и Z-фактор были приняты для оценки качества данных.[9] [12] Недавно была предложена строго стандартизированная разница средних значений ( SSMD ) для оценки качества данных в анализах HTS. [13] [14]
Соединение с желаемым эффектом в HTS называется хитом. Процесс выбора хитов называется отбором хитов. Аналитические методы отбора совпадений на скринингах без повторов (обычно на первичных скринингах) отличаются от методов с повторами (обычно на подтверждающих скринингах). Например, метод z-показателя подходит для экранов без повторов, тогда как t-статистика подходит для экранов с повторами. Расчет SSMD для экранов без повторов также отличается от расчета для экранов с повторами. [9]
Для отбора попаданий на первичных скринингах без повторов легко интерпретируемыми являются среднее кратное изменение, средняя разница, процент ингибирования и процент активности. Однако они не позволяют эффективно фиксировать изменчивость данных. Метод z-показателя или SSMD, который может фиксировать вариабельность данных на основе предположения, что каждое соединение имеет ту же вариабельность, что и отрицательный эталон на экранах.[15] [16] Однако в экспериментах HTS часто встречаются выбросы, а такие методы, как z-показатель, чувствительны к выбросам и могут быть проблематичными. Как следствие, для выбора совпадений были предложены и приняты надежные методы, такие как метод z*-показателя, SSMD*, метод B-показателя и метод на основе квантилей. [5] [9] [17] [18]
На скрининге с повторами мы можем напрямую оценить вариабельность каждого соединения; как следствие, нам следует использовать SSMD или t-статистику, которая не опирается на сильное предположение, на которое опираются z-показатель и z*-показатель. Одна из проблем с использованием t-статистики и связанных с ней значений p заключается в том, что на них влияют как размер выборки, так и размер эффекта. [19] Они получены в результате тестирования отсутствия средней разницы и, следовательно, не предназначены для измерения размера сложных эффектов. При выборе совпадения основной интерес представляет величина эффекта тестируемого соединения. SSMD напрямую оценивает размер эффектов. [20] Также было показано, что SSMD лучше, чем другие обычно используемые величины эффекта. [21] Популяционное значение SSMD сопоставимо в разных экспериментах, и, таким образом, мы можем использовать одно и то же пороговое значение для популяционного значения SSMD для измерения размера сложных эффектов. [22]
Уникальное распределение соединений по одному или нескольким планшетам можно использовать либо для увеличения количества анализов на планшет, либо для уменьшения дисперсии результатов анализа, либо для того и другого. Упрощающее предположение, сделанное в этом подходе, заключается в том, что любые соединения N в одной и той же лунке обычно не будут взаимодействовать друг с другом или с мишенью анализа таким образом, который фундаментально меняет способность анализа обнаруживать истинные совпадения.
Например, представьте себе планшет, на котором соединение A находится в лунках 1-2-3, соединение B — в лунках 2-3-4, а соединение C — в лунках 3-4-5. При анализе этого планшета с заданной мишенью попадание в лунки 2, 3 и 4 будет указывать на то, что соединение B является наиболее вероятным агентом, а также обеспечит три измерения эффективности соединения B против указанной мишени. Коммерческое применение этого подхода включает в себя комбинации, в которых никакие два соединения никогда не имеют общего более чем в одной лунке, чтобы уменьшить вероятность взаимодействия (второго порядка) между парами проверяемых соединений.
Автоматизация и форматы небольших объемов анализа были использованы учеными Центра химической геномики NIH (NCGC) для разработки количественного HTS (qHTS), парадигмы фармакологического профиля больших химических библиотек посредством создания полных зависимостей концентрация-реакция для каждого соединения. С помощью прилагаемого программного обеспечения для подбора кривых и хемоинформатического программного обеспечения данные qHTS дают половину максимальной эффективной концентрации (EC50), максимальный ответ, коэффициент Хилла (nH) для всей библиотеки, что позволяет оценить отношения активности зарождающейся структуры (SAR). [23]
В марте 2010 года было опубликовано исследование, демонстрирующее процесс HTS, позволяющий проводить скрининг в 1000 раз быстрее (100 миллионов реакций за 10 часов) при 1-миллионной стоимости (с использованием в 10-7 раз большего объема реагента), чем традиционные методы с использованием капельной микрофлюидики. [23] Капли жидкости, отделенные маслом, заменяют лунки микропланшета и позволяют проводить анализ и сортировку попаданий, пока реагенты текут по каналам.
В 2010 году исследователи разработали кремниевый лист линз, который можно разместить на микрофлюидных матрицах, чтобы обеспечить измерение флуоресценции 64 различных выходных каналов одновременно с помощью одной камеры. [24] Этот процесс может анализировать 200 000 капель в секунду.
В 2013 году исследователи раскрыли подход с использованием небольших молекул растений. В целом, очень важно обеспечить высококачественную проверку концепции на ранних стадиях процесса разработки лекарств. Здесь технологии, которые позволяют идентифицировать мощные, селективные и биодоступные химические зонды, представляют решающий интерес, даже если полученные соединения требуют дальнейшей оптимизации для разработки в фармацевтическом продукте. Ядерный рецептор RORα, белок, который уже более десяти лет используется для выявления мощных и биодоступных агонистов, был использован в качестве примера очень сложной мишени для лекарств. Попадания подтверждаются на этапе отбора благодаря колоколообразной кривой. Этот метод очень похож на количественный метод HTS (одновременный скрининг и подтверждение совпадения), за исключением того, что использование этого подхода значительно уменьшает количество точек данных и позволяет легко проверять более 100 000 биологически важных соединений. [25]
В то время как в традиционных препаратах HTS используются очищенные белки или интактные клетки, недавнее развитие технологии связано с использованием интактных живых организмов, таких как нематода Caenorhabditis elegans и рыбка данио ( Danio rerio ). [26]
В 2016–2018 годах производители пластин начали производить специализированную химию, позволяющую массово производить поверхности со сверхнизкой адгезией, отталкивающие клетки, что способствовало быстрой разработке поддающихся HTS анализов для поиска лекарств от рака в трехмерных тканях, таких как органоиды и сфероиды; более физиологически релевантный формат. [27] [28] [29]
HTS — относительно недавняя инновация, ставшая возможной во многом благодаря современным достижениям в области робототехники и высокоскоростных компьютерных технологий. Для проведения операции HTS по-прежнему требуется узкоспециализированная и дорогая скрининговая лаборатория, поэтому во многих случаях научно-исследовательское учреждение малого и среднего размера будет пользоваться услугами существующего центра HTS, а не создавать его для себя.
В академических кругах наблюдается тенденция к тому, что университеты становятся собственными предприятиями по разработке лекарств. [30] Эти средства, которые обычно имеются только в промышленности, теперь все чаще встречаются и в университетах. Например, в Калифорнийском университете в Лос-Анджелесе есть лаборатория HTS с открытым доступом «Общие ресурсы молекулярного скрининга» (MSSR, UCLA), которая может регулярно проверять более 100 000 соединений в день. Политика открытого доступа гарантирует, что исследователи со всего мира смогут воспользоваться этим объектом без длительных переговоров об интеллектуальной собственности. Имея библиотеку соединений, насчитывающую более 200 000 малых молекул, МССР имеет одну из крупнейших составных площадок среди всех университетов западного побережья. Кроме того, MSSR обладает полными функциональными возможностями геномики (широкогеномные siRNA, shRNA, кДНК и CRISPR), которые дополняют усилия по работе с малыми молекулами: Функциональная геномика использует возможности HTS для выполнения полногеномных скринингов, которые исследуют функцию каждого гена в интересующем контексте. либо выбивая каждый ген, либо сверхэкспрессируя его. Параллельный доступ к высокопроизводительному скринингу малых молекул и полногеномному скринингу позволяет исследователям выполнять идентификацию и проверку мишени для конкретного заболевания или определение способа действия небольшой молекулы. Наиболее точные результаты могут быть получены при использовании «массивных» библиотек функциональной геномики, т.е. каждая библиотека содержит одну конструкцию, такую как одна миРНК или кДНК. Функциональная геномика обычно сочетается с тщательным скринингом с использованием, например, эпифлуоресцентной микроскопии или лазерной сканирующей цитометрии.
В Университете Иллинойса также есть центр HTS, как и в Университете Миннесоты. В Институте наук о жизни Мичиганского университета находится установка HTS в Центре химической геномики. В Колумбийском университете есть общий ресурсный центр HTS, в котором хранятся около 300 000 различных малых молекул и около 10 000 известных биологически активных соединений, доступных для биохимического, клеточного и NGS-скрининга. В Университете Рокфеллера есть Ресурсный центр HTS с открытым доступом HTSRC (Университет Рокфеллера, HTSRC), который предлагает библиотеку, содержащую более 380 000 соединений. Лаборатория высокопроизводительного анализа Северо-Западного университета обеспечивает идентификацию, проверку, разработку методов анализа и скрининг соединений. Некоммерческий институт медицинских открытий Сэнфорда Бернэма Пребиса также имеет давнюю базу HTS в Центре химической геномики Конрада Пребиса, который был частью MLPCN. Некоммерческий Центр молекулярного скрининга Скриппса (SRMSC) [31] продолжает обслуживать научные круги в различных институтах после эпохи MLPCN. Центр SRMSC uHTS поддерживает одну из крупнейших библиотечных коллекций в академических кругах, в настоящее время насчитывающую более 665 000 объектов малых молекул, и регулярно проверяет всю коллекцию или дополнительные библиотеки в поддержку грантовых инициатив с несколькими PI.
В Соединенных Штатах Национальные институты здравоохранения (NIH) создали общенациональный консорциум центров скрининга малых молекул для производства инновационных химических инструментов для использования в биологических исследованиях. Сеть центров по производству зондов молекулярных библиотек (MLPCN) проводит HTS на основе анализов, предоставленных исследовательским сообществом, с использованием большой библиотеки малых молекул, хранящейся в центральном хранилище молекул.