G418 ( генетицин ) — аминогликозидный антибиотик , схожий по структуре с гентамицином B1 . Он вырабатывается Micromonospora rhodorangea . [1] G418 блокирует синтез полипептида , ингибируя стадию удлинения как в прокариотических , так и в эукариотических клетках. [1] Устойчивость к G418 обеспечивается геном neo из Tn5, кодирующим аминогликозид 3'-фосфотрансферазу, APT 3' II. [1] G418 является аналогом сульфата неомицина и имеет механизм, аналогичный неомицину . G418 обычно используется в лабораторных исследованиях для отбора генетически модифицированных клеток. [2] Обычно для бактерий и водорослей используются концентрации 5 мкг/мл или менее, для клеток млекопитающих концентрации приблизительно 400 мкг/мл используются для отбора и 200 мкг/мл для поддержания. Однако оптимальная концентрация для отбора резистентных клонов в клетках млекопитающих зависит от используемой клеточной линии , а также от плазмиды, несущей ген резистентности, поэтому следует провести титрование антибиотика, чтобы найти наилучшие условия для каждой экспериментальной системы. Титрование следует проводить с использованием концентраций антибиотика в диапазоне от 100 мкг/мл до 1400 мкг/мл. Отбор резистентных клонов может занять от 1 до 3 недель. [ необходима цитата ]
G418 производится путем ферментации и изоляции, а штамм Micromonospora rhodorangea, продуцирующий G418 , производит много других гентамицинов, одновременно производя G418. Распространенные примеси G418 включают гентамицины A, C1, C1a, C2, C2a и X2. [3] Качество G418 основано не только на эффективности, но и на селективности, определяемой кривой гибели чувствительных клеток по сравнению с резистентными клетками. Хороший продукт G418 имеет самую низкую LD 50 для чувствительных клеток (таких как NIH 3T3 ) и самую высокую LD 50 (может достигать 5000 мкг/мл) для резистентных клеток (NIH 3T3, трансфицированных резистентными генами). Гентамицины практически не обладают селективностью, за исключением гентамицина X2. [4]
G418 обычно используется в качестве селективного агента в установках клеточной культуры. Исследователи могут связать селективный ген резистентности neoR со своим вектором. Затем, если вектор успешно введен в клетки, клетки могут стать клетками, устойчивыми к G418. После обработки G418 эти векторные (-) клетки погибнут, в то время как векторные (+) клетки выживут. Этот метод может помочь исследователям выбрать векторные (+) клетки. [1] [5]
G418 Дисульфат и другие аминогликозиды предотвращают синтез белка на ранних стадиях удлинения, пост-инициации, инициации трансляции. Устойчивость к G418 Дисульфату обеспечивается геном устойчивости к неомицину ( neo) из транспозонов Tn5 или Tn601 (903). Клетки, трансфицированные плазмидами устойчивости, содержащими ген neo , могут экспрессировать аминогликозид 3'-фосфотрансферазу (APT 3' I или APT 3' II), которая ковалентно модифицирует G418 в 3-фосфорный G418, который имеет незначительную активность и низкое сродство к прокариотическим и эукариотическим рибосомам. [6]