stringtranslate.com

Ген-репортер

Схема того, как репортерный ген используется для изучения регуляторной последовательности.

В молекулярной биологии репортерный ген ( часто просто репортер ) — это ген , который исследователи прикрепляют к регуляторной последовательности другого интересующего гена в бактериях , клеточной культуре , животных или растениях. Такие гены называются репортерами, потому что характеристики, которые они придают экспрессирующим их организмам, легко идентифицируются и измеряются, или потому что они являются селективными маркерами . Репортерные гены часто используются в качестве индикатора того, был ли определенный ген принят или экспрессирован в популяции клеток или организмов.

Общие репортерные гены

Чтобы ввести репортерный ген в организм, ученые помещают репортерный ген и интересующий ген в одну и ту же конструкцию ДНК для вставки в клетку или организм. Для бактерий или прокариотических клеток в культуре это обычно происходит в форме кольцевой молекулы ДНК, называемой плазмидой . Для вирусов это известно как вирусный вектор . Важно использовать репортерный ген, который изначально не экспрессируется в исследуемой клетке или организме, поскольку экспрессия репортера используется в качестве маркера для успешного усвоения интересующего гена. [1]

Обычно используемые репортерные гены, которые вызывают визуально идентифицируемые характеристики, обычно включают флуоресцентные и люминесцентные белки. Примерами являются ген, кодирующий зеленый флуоресцентный белок медузы (GFP), который заставляет клетки , которые его экспрессируют, светиться зеленым под синим или ультрафиолетовым светом, [2] фермент люцифераза , который катализирует реакцию с люциферином для получения света, и красный флуоресцентный белок из гена dsRed  [fr] . [3] [4] [5] [6] [7] Ген GUS обычно используется в растениях, но люцифераза и GFP становятся все более распространенными. [8] [9]

Распространенным репортером в бактериях является ген E. coli lacZ , который кодирует белок бета-галактозидазу . [10] Этот фермент заставляет бактерии, экспрессирующие этот ген, казаться синими при выращивании на среде, содержащей аналог субстрата X-gal . Примером селективного маркера, который также является репортером в бактериях, является ген хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT), который придает устойчивость к антибиотику хлорамфениколу . [11]

Анализы трансформации и трансфекции

Многие методы трансфекции и трансформации — два способа экспрессии чужеродного или модифицированного гена в организме — эффективны только для небольшого процента популяции, подвергнутой этим методам. [13] [14] Таким образом, необходим метод идентификации этих немногих успешных событий захвата гена. Гены-репортеры, используемые таким образом, обычно экспрессируются под собственным промотором (области ДНК, которые инициируют транскрипцию гена), независимым от промотора введенного интересующего гена; ген-репортер может экспрессироваться конститутивно (то есть он «всегда включен») или индуцироваться внешним вмешательством, таким как введение изопропил β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) в систему β-галактозидазы. [10] В результате экспрессия гена-репортера не зависит от экспрессии интересующего гена, что является преимуществом, когда интересующий ген экспрессируется только при определенных специфических условиях или в тканях, к которым трудно получить доступ. [1]

В случае репортеров селективных маркеров, таких как CAT, трансфицированная популяция бактерий может быть выращена на субстрате, содержащем хлорамфеникол . Только те клетки, которые успешно приняли конструкцию, содержащую ген CAT, выживут и будут размножаться в этих условиях. [11]

Анализы экспрессии генов

Гены-репортеры могут использоваться для анализа экспрессии интересующего гена, который обычно трудно количественно оценить. [1] Гены-репортеры могут производить белок, который имеет мало очевидного или немедленного эффекта на клеточную культуру или организм. В идеале они не присутствуют в нативном геноме, чтобы иметь возможность изолировать экспрессию гена-репортера в результате экспрессии интересующего гена. [1] [15]

Чтобы активировать репортерные гены, их можно экспрессировать конститутивно , когда они напрямую присоединены к интересующему гену для создания слияния генов . [16] Этот метод является примером использования цис -действующих элементов, когда два гена находятся под одними и теми же промоторными элементами и транскрибируются в одну молекулу информационной РНК . Затем мРНК транслируется в белок. Важно, чтобы оба белка могли правильно складываться в свои активные конформации и взаимодействовать со своими субстратами, несмотря на слияние. При построении конструкции ДНК обычно включается сегмент ДНК, кодирующий гибкую область полипептидного линкера, так что репортер и продукт гена будут лишь минимально мешать друг другу. [17] [18] Репортерные гены также могут экспрессироваться путем индукции во время роста. В этих случаях для экспрессии репортерного гена используются транс -действующие элементы, такие как факторы транскрипции . [19] [20]

Анализ гена-репортера все чаще используется в высокопроизводительном скрининге (HTS) для идентификации малых молекулярных ингибиторов и активаторов белковых мишеней и путей для открытия лекарств и химической биологии . Поскольку сами ферменты-репортеры (например, люцифераза светлячков ) могут быть прямыми мишенями малых молекул и затруднять интерпретацию данных HTS, были разработаны новые конструкции репортеров совпадений, включающие подавление артефактов. [21] [22]

Анализы промотора

Гены-репортеры могут использоваться для анализа активности конкретного промотора в клетке или организме. [23] В этом случае нет отдельного «гена интереса»; ген-репортер просто помещается под контроль целевого промотора, а активность продукта гена-репортера количественно измеряется. Результаты обычно сообщаются относительно активности под «консенсусным» промоутером, который, как известно, вызывает сильную экспрессию гена. [24]

Дальнейшее использование

Более сложное использование генов-репортеров в больших масштабах осуществляется в двугибридном скрининге , целью которого является выявление белков, которые изначально взаимодействуют друг с другом in vivo . [25]

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ abcd Дебнат, Моусуми; Прасад, Годаварти БКС; Бисен, Пракаш С. (2010), Дебнат, Моусуми; Прасад, Годаварти БКС; Бисен, Пракаш С. (ред.), «Ген-репортер», Молекулярная диагностика: обещания и возможности , Springer Нидерланды, стр. 71–84, doi : 10.1007/978-90-481-3261-4_5, ISBN 978-90-481-3261-4
  2. ^ van Thor, Jasper J.; Gensch, Thomas; Hellingwerf, Klaas J.; Johnson, Louise N. (январь 2002 г.). «Фототрансформация зеленого флуоресцентного белка под действием УФ- и видимого света приводит к декарбоксилированию глутамата 222». Nature Structural Biology . 9 (1): 37–41. doi :10.1038/nsb739. ISSN  1072-8368. PMID  11740505.
  3. ^ ab Soboleski, Mark R.; Oaks, Jason; Halford, William P. (март 2005 г.). «Зеленый флуоресцентный белок — количественный репортер экспрессии генов в отдельных эукариотических клетках». The FASEB Journal . 19 (3): 440–442. doi : 10.1096/fj.04-3180fje . ISSN  0892-6638. PMC 1242169. PMID  15640280 . 
  4. ^ ab Smale, ST (2010-05-01). "Анализ люциферазы". Cold Spring Harbor Protocols . 2010 (5): pdb.prot5421. doi :10.1101/pdb.prot5421. ISSN  1559-6095. PMID  20439408.
  5. ^ Jach, Guido; Binot, Elke; Frings, Sabine; Luxa, Kerstin; Schell, Jeff (2001). «Использование красного флуоресцентного белка Discosoma sp. (dsRED) в качестве репортера для экспрессии генов растений». The Plant Journal . 28 (4): 483–491. doi :10.1046/j.1365-313X.2001.01153.x. ISSN  1365-313X. PMID  11737785.
  6. ^ Чжан, Цисян; Валаваге, Шриема Л.; Триколи, Дэвид М.; Дандекар, Абхайя М.; Лесли, Чарльз А. (май 2015 г.). «Красный флуоресцентный белок (DsRED) из Discosoma sp. как репортер для экспрессии генов в соматических эмбрионах грецкого ореха». Plant Cell Reports . 34 (5): 861–869. doi :10.1007/s00299-015-1749-1. ISSN  1432-203X. PMID  25627255. S2CID  9184712.
  7. ^ Миккельсен, Лизбет; Саррокко, Сабрина; Любек, Метте; Йенсен, Дэн Фанк (2003-06-01). «Экспрессия красного флуоресцентного белка DsRed-Express в нитчатых грибах-аскомицетах». FEMS Microbiology Letters . 223 (1): 135–139. doi : 10.1016/S0378-1097(03)00355-0 . ISSN  0378-1097. PMID  12799012.
  8. ^ Халл, Джиллиан А.; Девич, Мартин (1995), Джонс, Хеддвин (ред.), «Ген системы репортерных генов β-глюкуронидазы (Gus): слияния; спектрофотометрическое, флуорометрическое и гистохимическое обнаружение», Протоколы переноса и экспрессии генов растений , Методы в молекулярной биологии, т. 49, Springer New York, стр. 125–141, doi :10.1385/0-89603-321-x:125, ISBN 978-1-59259-536-5, PMID  8563799
  9. ^ Koo, J.; Kim, Y.; Kim, J.; Yeom, M.; Lee, IC; Nam, HG (2007). «GUS/Luciferase Fusion Reporter for Plant Gene Trapping and for Assay of Promoter Activity with Luciferin-Dependent Control of the Reporter Protein Stability». Plant and Cell Physiology . 48 (8): 1121–1131. doi : 10.1093/pcp/pcm081 . PMID  17597079.
  10. ^ abc Смейл, СТ (2010-05-01). "-Анализ галактозидазы". Cold Spring Harbor Protocols . 2010 (5): pdb.prot5423. doi :10.1101/pdb.prot5423. ISSN  1559-6095. PMID  20439410.
  11. ^ abc Смейл, СТ (2010-05-01). "Анализ ацетилтрансферазы хлорамфеникола". Cold Spring Harbor Protocols . 2010 (5): pdb.prot5422. doi :10.1101/pdb.prot5422. ISSN  1559-6095. PMID  20439409.
  12. ^ Нордгрен, IK; Тавассоли, A (2014). «Двунаправленная флуоресцентная двухгибридная система для мониторинга белок-белковых взаимодействий». Molecular BioSystems . 10 (3): 485–90. doi : 10.1039/c3mb70438f . PMID  24382456. S2CID  12713372.
  13. ^ Ханахан, Дуглас; Джесси, Джоэл; Блум, Фредрик Р. (1991-01-01), "[4] Плазмидная трансформация Escherichia coli и других бактерий", Бактериальные генетические системы , Методы в энзимологии, т. 204, Academic Press, стр. 63–113, doi :10.1016/0076-6879(91)04006-a, ISBN 9780121821050, PMID  1943786
  14. ^ Ханахан, Дуглас (1983-06-05). «Исследования по трансформации Escherichia coli с помощью плазмид». Журнал молекулярной биологии . 166 (4): 557–580. CiteSeerX 10.1.1.460.2021 . doi :10.1016/S0022-2836(83)80284-8. ISSN  0022-2836. PMID  6345791. 
  15. ↑ Архивировано в Ghostarchive и Wayback Machine: Promega Corporation, Promega Corporation (22 октября 2014 г.). «Введение в анализы генов-репортеров». YouTube . Получено 21 марта 2020 г. .
  16. ^ de Jong, Hidde; Geiselmann, Johannes (2015). «Флуоресцентные репортерные гены и анализ бактериальных регуляторных сетей». В Maler, Oded; Halász, Ádám; Dang, Thao; Piazza, Carla (ред.). Гибридная системная биология . Конспект лекций по информатике. Том 7699. Springer International Publishing. стр. 27–50. doi :10.1007/978-3-319-27656-4_2. ISBN 978-3-319-27656-4.
  17. ^ Спектор, Дэвид Л.; Голдман, Роберт Д. (2006-12-01). «Конструирование и экспрессия белков слияния GFP». Cold Spring Harbor Protocols . 2006 (7): pdb.prot4649. doi :10.1101/pdb.prot4649. PMID  22484672.
  18. ^ Чэнь, Сяоин; Заро, Дженника; Шэнь, Вэй-Чан (2013-10-15). «Линкеры белков слияния: свойство, дизайн и функциональность». Advanced Drug Delivery Reviews . 65 (10): 1357–1369. doi :10.1016/j.addr.2012.09.039. ISSN  0169-409X. PMC 3726540. PMID  23026637 . 
  19. ^ Ханко, Эрик КР; Минтон, Найджел П.; Малис, Наглис (2019-01-01), «Глава девятая — Разработка, клонирование и характеристика систем индуцируемой экспрессии генов на основе факторов транскрипции», в Шукла, Арун К. (ред.), Подходы химической и синтетической биологии к пониманию клеточных функций — часть A , Методы в энзимологии, т. 621, Academic Press, стр. 153–169, doi : 10.1016/bs.mie.2019.02.018, ISBN 978-0-12-818117-1, PMID  31128776, S2CID  91744525 , получено 2019-12-16
  20. ^ Каллунки, Туула; Баришич, Марин; Яэттеля, Марья; Лю, Бинь (30 июля 2019 г.). «Как выбрать правильную систему экспрессии индуцируемых генов для исследований на млекопитающих?». Клетки . 8 (8): 796. doi : 10.3390/cells8080796 . ISSN  2073-4409. ПМК 6721553 . ПМИД  31366153. 
  21. ^ Ченг, К. К.; Инглезе, Дж. (2012). «Система генов-репортеров совпадений для высокопроизводительного скрининга». Nature Methods . 9 (10): 937. doi :10.1038/nmeth.2170. PMC 4970863 . PMID  23018994. 
  22. ^ Hasson, SA; Fogel, AI; Wang, C.; MacArthur, R.; Guha, R.; Heman-Ackahc, S.; Martin, S.; Youle, RJ; Inglese, J. (2015). «Хемогенное профилирование эндогенной экспрессии PARK2 с использованием репортера совпадений, отредактированного геномом». ACS Chem. Biol . 10 (5): 1188–1197. doi :10.1021/cb5010417. PMC 9927027. PMID 25689131.  S2CID 20139739  . 
  23. ^ Джагдер, Бат-Эрден; Уэлч, Джеффри; Брейди, Нади; Маркиз, Кристофер П. (2016-07-26). "Конструирование и использование слияния промотора растворимой гидрогеназы (PSH) Cupriavidus necatorH16 с gfp (зеленым флуоресцентным белком)". PeerJ . 4 : e2269. doi : 10.7717/peerj.2269 . ISSN  2167-8359. PMC 4974937 . PMID  27547572. 
  24. ^ Солберг, Нина; Краусс, Стефан (2013). «Анализ люциферазы для изучения активности клонированного фрагмента ДНК промотора». Регуляция генов . Методы в молекулярной биологии. Т. 977. С. 65–78. doi :10.1007/978-1-62703-284-1_6. ISBN 978-1-62703-283-4. ISSN  1940-6029. PMID  23436354.
  25. ^ Брюкнер, Анна; Польж, Сесиль; Ленце, Николас; Ауэрбах, Даниэль; Шлаттнер, Уве (18.06.2009). «Двугибридные дрожжи — мощный инструмент для системной биологии». Международный журнал молекулярных наук . 10 (6): 2763–2788. doi : 10.3390/ijms10062763 . ISSN  1422-0067. PMC 2705515. PMID  19582228 . 

Внешние ссылки