Гибридомная технология — это метод производства большого количества идентичных антител (также называемых моноклональными антителами ). Этот процесс начинается с инъекции мыши (или другому млекопитающему) антигена , вызывающего иммунный ответ. Тип лейкоцитов, В-клетки , вырабатывает антитела, которые связываются с введенным антигеном. Эти В-клетки, продуцирующие антитела, затем собирают у мышей и, в свою очередь, сливают с бессмертными раковыми клетками миеломы (клетки миеломы представляют собой раковые плазматические клетки; плазматические клетки происходят из активированных В-клеток), чтобы получить гибридную клеточную линию , называемую гибридомой. , который обладает как способностью В-клеток продуцировать антитела, так и долговечностью и репродуктивной способностью миеломы. Гибридомы можно выращивать в культуре, причем каждая культура начинается с одной жизнеспособной гибридомной клетки, получая культуры, каждая из которых состоит из генетически идентичных гибридом, которые продуцируют одно антитело на культуру (моноклональные), а не смеси различных антител (поликлональные). Линия клеток миеломы, используемая в этом процессе, отбирается по ее способности расти в культуре ткани и по отсутствию синтеза антител. В отличие от поликлональных антител , которые представляют собой смеси множества различных молекул антител, моноклональные антитела, продуцируемые каждой линией гибридомы, химически идентичны.
Производство моноклональных антител было изобретено Сезаром Мильштейном и Жоржем Дж. Ф. Кёлером в 1975 году. Они разделили Нобелевскую премию 1984 года по медицине и физиологии с Нильсом Каем Йерне , который внес другой вклад в иммунологию. Термин «гибридома» был придуман Леонардом Герценбергом во время его творческого отпуска в лаборатории Сезара Мильштейна в 1976–1977 годах. [1]
Лабораторные животные ( млекопитающие , например мыши) сначала подвергаются воздействию антигена, против которого должны быть выработаны антитела. Обычно это делается путем серии инъекций рассматриваемого антигена в течение нескольких недель. За этими инъекциями обычно следует электропорация in vivo , которая значительно усиливает иммунный ответ. После выделения спленоцитов из селезенки млекопитающего В-клетки сливаются с иммортализованными клетками миеломы. Слияние В-клеток с клетками миеломы можно осуществить с помощью электрослияния. Электрослияние заставляет В-клетки и клетки миеломы выравниваться и сливаться под действием электрического поля. Альтернативно, B-клетки и миеломы можно слить с помощью химических протоколов, чаще всего с использованием полиэтиленгликоля . Клетки миеломы отбираются заранее, чтобы убедиться, что они сами не секретируют антитела и что в них отсутствует ген гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы (HGPRT), что делает их чувствительными (или уязвимыми) к среде HAT (см. ниже).
Слитые клетки инкубируют в среде HAT ( среда гипоксантин - аминоптерин - тимидин ) в течение примерно 10-14 дней. Аминоптерин блокирует путь, обеспечивающий синтез нуклеотидов. Следовательно, неслитые клетки миеломы погибают, поскольку они не могут производить нуклеотиды путем de novo или путем спасения , поскольку у них отсутствует HGPRT. Удаление несросшихся клеток миеломы необходимо, поскольку они могут перерасти другие клетки, особенно слабо прижившиеся гибридомы. Неслитые В-клетки умирают, поскольку имеют короткую продолжительность жизни. Таким образом, выживают только гибриды В-клеток и миеломы, поскольку ген HGPRT, происходящий из В-клеток, функционален. Эти клетки вырабатывают антитела (свойство В-клеток) и бессмертны (свойство клеток миеломы). Инкубируемую среду затем разводят в многолуночные планшеты до такой степени, чтобы каждая лунка содержала только одну клетку. Поскольку антитела в лунке производятся одной и той же В-клеткой, они будут направлены к одному и тому же эпитопу и, таким образом, являются моноклональными антителами.
Следующим этапом является быстрый процесс первичного скрининга, в ходе которого выявляются и отбираются только те гибридомы, которые продуцируют антитела соответствующей специфичности. Первый использованный метод скрининга называется ELISA . Затем инкубируют супернатант культуры гибридомы, конъюгат, меченный вторичным ферментом, и хромогенный субстрат, и образование окрашенного продукта указывает на положительную гибридому. Альтернативно, иммуноцитохимический, [2] вестерн-блоттинг и иммунопреципитационная масс-спектрометрия. В отличие от вестерн-блот-анализа, иммунопреципитационная масс-спектрометрия облегчает скрининг и ранжирование клонов, которые связываются с нативными (неденатурированными) формами антигенных белков. [3] Скрининг проточной цитометрией использовался для первичного скрининга большого количества (~ 1000) клонов гибридом, распознающих нативную форму антигена на поверхности клетки. [4] При скрининге на основе проточной цитометрии смесь антиген-отрицательных и антиген-положительных клеток используется в качестве антигена, подлежащего тестированию для каждого образца супернатанта гибридомы. [4]
В-клетку, продуцирующую нужные антитела, можно клонировать для получения множества идентичных дочерних клонов. На этом этапе необходимы дополнительные среды, содержащие интерлейкин-6 (например, бриклон). Как только колония гибридомы создана, она будет постоянно расти в культуральной среде, такой как RPMI-1640 (с антибиотиками и фетальной бычьей сывороткой), и продуцировать антитела. [2]
Многолуночные планшеты первоначально используются для выращивания гибридом, а после отбора их заменяют на более крупные колбы для тканевых культур. Это поддерживает благополучие гибридом и обеспечивает достаточное количество клеток для криоконсервации и супернатанта для последующих исследований. Культуральный супернатант может давать от 1 до 60 мкг/мл моноклональных антител, которые поддерживают при -20°C или ниже до тех пор, пока они не потребуются. [2]
Используя культуральный супернатант или очищенный препарат иммуноглобулина, можно провести дальнейший анализ потенциальной гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела, с точки зрения реактивности, специфичности и перекрестной реактивности. [2]
Использование моноклональных антител широко распространено и включает профилактику, диагностику и лечение заболеваний. Например, моноклональные антитела могут различать подгруппы В-клеток и Т-клеток , что полезно при выявлении различных типов лейкозов . Кроме того, для определения маркеров клеточной поверхности лейкоцитов и других типов клеток использовались специфические моноклональные антитела . Это привело к кластерной дифференцировке серии маркеров. Их часто называют маркерами CD, и они определяют несколько сотен различных компонентов клеточной поверхности, каждый из которых определяется связыванием определенного моноклонального антитела. Такие антитела чрезвычайно полезны для сортировки клеток, активируемой флуоресценцией , специфической изоляции определенных типов клеток.
С помощью моноклональных антител ткани и органы можно классифицировать на основе экспрессии определенных маркеров, отражающих тканевый или клеточный генезис. Специфический антиген простаты , плацентарная щелочная фосфатаза , хорионический гонадотропин человека , α-фетопротеин и другие являются органассоциированными антигенами, и продукция моноклональных антител против этих антигенов помогает в определении природы первичной опухоли. [2]
Моноклональные антитела особенно полезны при различении морфологически сходных поражений, таких как мезотелиома плевры и брюшины , аденокарцинома , а также при определении органного или тканевого происхождения недифференцированных метастазов . Отобранные моноклональные антитела помогают в обнаружении скрытых метастазов ( рак неизвестного первичного происхождения ) с помощью иммуноцитологического анализа костного мозга, аспиратов других тканей, а также лимфатических узлов и других тканей и могут иметь повышенную чувствительность по сравнению с обычным гистопатологическим окрашиванием . [2]
В одном исследовании [5] был проведен чувствительный иммуногистохимический анализ аспиратов костного мозга 20 пациентов с локализованным раком предстательной железы. В анализе использовали три моноклональных антитела (Т16, С26 и АЕ-1), способные распознавать мембранные и цитоскелетные антигены, экспрессируемые эпителиальными клетками, для обнаружения опухолевых клеток. Аспираты костного мозга 22% пациентов с локализованным раком простаты (стадия B, 0/5; стадия C, 2/4) и 36% пациентов с метастатическим раком простаты (стадия D1, 0/7 пациентов; стадия D2, 4/). у 4 пациентов) в костном мозге были антиген-положительные клетки. Был сделан вывод, что иммуногистохимическое окрашивание аспиратов костного мозга очень полезно для выявления скрытых метастазов в костный мозг у пациентов с явно локализованным раком предстательной железы.
Хотя иммуноцитохимия с использованием опухолеассоциированных моноклональных антител привела к улучшению способности обнаруживать скрытые клетки рака молочной железы в аспиратах костного мозга и периферической крови, необходима дальнейшая разработка этого метода, прежде чем его можно будет использовать в рутинном порядке. [6] Одним из основных недостатков иммуноцитохимии является то, что используются только опухолеассоциированные, а не опухолеспецифические моноклональные антитела, и в результате могут возникнуть некоторые перекрестные реакции с нормальными клетками. [7]
Чтобы эффективно определить стадию рака молочной железы и оценить эффективность схем очистки перед инфузией аутологичных стволовых клеток, важно обнаружить даже небольшие количества клеток рака молочной железы. Иммуногистохимические методы идеально подходят для этой цели, поскольку они просты, чувствительны и достаточно специфичны. Франклин и др. [8] выполнили чувствительный иммуноцитохимический анализ с использованием комбинации четырех моноклональных антител (260F9, 520C9, 317G5 и BrE-3) против гликопротеинов поверхности опухолевых клеток для идентификации клеток опухоли молочной железы в костном мозге и периферической крови. На основании результатов они пришли к выводу, что иммуноцитохимическое окрашивание костного мозга и периферической крови является чувствительным и простым способом обнаружения и количественного определения клеток рака молочной железы.
Одной из основных причин метастатического рецидива у больных солидными опухолями является ранняя диссеминация злокачественных клеток. Использование моноклональных антител (мАт), специфичных к цитокератинам, позволяет идентифицировать диссеминированные отдельные эпителиальные опухолевые клетки в костном мозге.
В одном исследовании [9] сообщается о разработке иммуноцитохимической процедуры для одновременного мечения компонента цитокератина №. 18 (CK18) и специфический антиген простаты (PSA). Это поможет в дальнейшей характеристике диссеминированных отдельных эпителиальных опухолевых клеток у пациентов с раком простаты. Двенадцать контрольных аспиратов пациентов с доброкачественной гипертрофией предстательной железы показали отрицательное окрашивание, что еще раз подтверждает специфичность CK18 при обнаружении эпителиальных опухолевых клеток в костном мозге.
В большинстве случаев злокачественного заболевания, осложненного выпотом, неопластические клетки можно легко распознать. Однако в некоторых случаях злокачественные клетки не так легко увидеть или их присутствие слишком сомнительно, чтобы называть это положительным результатом. Использование иммуноцитохимических методов повышает точность диагностики в этих случаях.
Гош, Мейсон и Сприггс [10] проанализировали 53 образца плевральной и перитонеальной жидкости от 41 пациента со злокачественными новообразованиями. Традиционное цитологическое исследование не выявило опухолевых клеток. Для поиска злокачественных клеток использовали три моноклональных антитела (анти-CEA, Ca 1 и HMFG-2). Иммуноцитохимическое мечение проводили на неокрашенных мазках, хранившихся при температуре -20°С до 18 месяцев. В двенадцати из сорока одного случая иммуноцитохимического окрашивания были выявлены злокачественные клетки. Результат представляет собой увеличение точности диагностики примерно на 20%. Исследование пришло к выводу, что у пациентов с подозрением на злокачественное заболевание иммуноцитохимическая маркировка должна использоваться регулярно при исследовании цитологически отрицательных образцов и имеет важные последствия для ведения пациентов.
Другое применение иммуноцитохимического окрашивания — обнаружение двух антигенов в одном мазке. Двойное окрашивание антителами к легкой цепи и маркерами Т- и В-клеток может указывать на неопластическое происхождение лимфомы. [11]
В одном исследовании сообщалось о выделении линии гибридомных клеток (клон 1E10), которая продуцирует моноклональные антитела (IgM, изотип k). Это моноклональное антитело демонстрирует специфическое иммуноцитохимическое окрашивание ядрышек. [12]
Ткани и опухоли можно классифицировать на основе экспрессии определенных маркеров с помощью моноклональных антител. Они помогают различить морфологически сходные образования и определить органное или тканевое происхождение недифференцированных метастазов. Иммуноцитологический анализ костного мозга, аспиратов тканей, лимфатических узлов и т. д. с использованием выбранных моноклональных антител помогает выявить оккультные метастазы. Моноклональные антитела повышают чувствительность при обнаружении даже небольших количеств инвазивных или метастатических клеток. Моноклональные антитела (мАт), специфичные к цитокератинам, позволяют обнаружить диссеминированные отдельные эпителиальные опухолевые клетки в костном мозге.