2D-гели (окрашивание Кумасси)Роботы используются для выделения белковых пятен из 2D-гелей в современных лабораториях.
Двумерный гель-электрофорез , сокращенно 2-DE или 2-D электрофорез , представляет собой форму гель-электрофореза , обычно используемую для анализа белков . Смеси белков разделяются по двум свойствам в двух измерениях на 2D-гелях. 2-DE был впервые независимо представлен О'Фарреллом [1] и Клозе [2] в 1975 году.
Основание для разделения
2-D электрофорез начинается с электрофореза в первом измерении, а затем молекулы разделяются перпендикулярно первому, чтобы создать электрофореграмму во втором измерении. При электрофорезе в первом измерении молекулы разделяются линейно в соответствии с их изоэлектрической точкой. Затем во втором измерении молекулы разделяются под углом 90 градусов от первой электрофореграммы в соответствии с молекулярной массой. Поскольку маловероятно, что две молекулы будут схожи по двум различным свойствам, молекулы разделяются более эффективно при 2-D электрофорезе, чем при 1-D электрофорезе.
Двумя измерениями, на которые белки разделяются с помощью этого метода, могут быть изоэлектрическая точка , масса белкового комплекса в нативном состоянии или масса белка .
Разделение по изоэлектрической точке называется изоэлектрической фокусировкой . Таким образом, к гелю прикладывается градиент pH, и поперек геля прикладывается электрический потенциал, делая один конец более положительным, чем другой. При всех значениях pH, отличных от их изоэлектрической точки, белки будут заряжены. Если они заряжены положительно, они будут притянуты к более отрицательному концу геля, а если они заряжены отрицательно, они будут притянуты к более положительному концу геля. Белки, нанесенные в первом измерении, будут двигаться по гелю и накапливаться в своей изоэлектрической точке; то есть точка, в которой общий заряд белка равен 0 (нейтральный заряд).
Разделение по массе белкового комплекса осуществляется с помощью нативного ПААГ , при котором белки остаются в нативном состоянии и разделяются в электрическом поле по их массе и массе их комплексов соответственно. Чтобы добиться разделения по размеру, а не по суммарному заряду, как в ИЭФ, к белкам переносится дополнительный заряд с помощью кумасси-бриллиантового синего или додецилсульфата лития. Знание белкового комплекса важно для анализа функционирования белков в клетке , поскольку белки в основном действуют вместе в комплексах, чтобы быть полностью функциональными. Анализ этой суборганоидной организации клетки требует методов, сохраняющих нативное состояние белковых комплексов .
Разделение по массе обычно достигается с помощью SDS-PAGE . ДСН денатурирует белки, расщепляет большинство комплексов и примерно выравнивает соотношение массы к заряду. SDS необходимо использовать как второе, перпендикулярное измерение, поскольку оно разрушает комплексы (делает невозможным собственный PAGE) и уравнивает отношения массы к заряду (делает невозможным IEF).
Обнаружение белков
В результате получается гель с распределенными по поверхности белками. Эти белки затем можно обнаружить различными способами, но наиболее часто используемыми красителями являются окрашивание серебром и кумасси бриллиантовым синим. В первом случае на гель наносится коллоид серебра. Серебро связывается с цистеиновыми группами внутри белка. Серебро темнеет под воздействием ультрафиолета. Количество серебра может быть связано с темнотой и, следовательно, с количеством белка в данном месте геля. Это измерение может дать только приблизительные суммы, но достаточно для большинства целей. Окрашивание серебром в 100 раз более чувствительно, чем окрашивание бриллиантовым синим Кумасси, с диапазоном линейности в 40 раз. [3]
Молекулы, отличные от белков, можно разделить с помощью 2D-электрофореза. В анализах суперспирализации спиральная ДНК разделяется в первом измерении и денатурируется интеркалятором ДНК (таким как бромид этидия или менее канцерогенный хлорохин ) во втором. Это сравнимо с комбинацией нативного ПААГ/ДСН-ПААГ при разделении белков.
Общие методы
ИПГ-ДАЛЬТ
Распространенным методом является использование иммобилизованного градиента pH (IPG) в первом измерении. Этот метод называется IPG-DALT . Образец сначала разделяют на гель IPG (который имеется в продаже), затем гель разрезают на кусочки для каждого образца, который затем уравновешивают в SDS-меркаптоэтаноле и наносят на гель SDS-PAGE для разделения во втором измерении. Обычно IPG-DALT не используется для количественного определения белков из-за потери низкомолекулярных компонентов во время переноса в гель SDS-PAGE. [4]
Деформация: изображения двух гелей для 2D-электрофореза, наложенных Delta2D. Первое изображение окрашено в оранжевый цвет, второе — в синий. Из-за различий в ходе соответствующие места не перекрываются.Деформация: изображения двух гелей для двумерного электрофореза после деформации. Первое изображение окрашено в оранжевый цвет, второе — в синий. Соответствующие пятна перекрываются после деформации. Обычные пятна окрашены в черный цвет, оранжевые пятна присутствуют (или гораздо сильнее) только на первом изображении, синие пятна присутствуют (или гораздо сильнее) на втором изображении.
В количественной протеомике эти инструменты в первую очередь анализируют биомаркеры путем количественного определения отдельных белков и демонстрации разделения между одним или несколькими белковыми «пятнами» на сканированном изображении геля 2-DE. Кроме того, эти инструменты сопоставляют пятна между гелями схожих образцов, чтобы показать, например, протеомные различия между ранними и поздними стадиями заболевания. Пакеты программного обеспечения включают, среди прочего, Delta2D (снято с производства), ImageMaster (снято с производства), Melanie, PDQuest (снято с производства), SameSpots и REDFIN. [ нужна цитата ] Хотя эта технология широко используется, интеллект не был усовершенствован. Например, хотя PDQuest и SameSpots, как правило, согласны в количественном определении и анализе четко определенных и хорошо разделенных белковых пятен, они дают разные результаты и тенденции анализа с менее определенными и менее разделенными пятнами. [5] Ранее были опубликованы сравнительные исследования, призванные помочь исследователям выбрать «лучшее» программное обеспечение для анализа. [6] Хотя Sciugo обычно используется для стандартного гель-электрофореза , его также можно использовать для создания фигур и количественного анализа.
Проблемы автоматического программного анализа включают не полностью разделенные (перекрывающиеся) пятна (менее определенные или разделенные), слабые места/шум (например, «призрачные пятна»), различия между гелями (например, белок мигрирует в разные положения в разных гелях). ), несовпадающие/необнаруженные пятна, что приводит к пропущенным значениям , [7] [8] несовпадающие пятна, ошибки количественного определения (несколько отдельных пятен могут быть ошибочно обнаружены программным обеспечением как одно пятно, а части пятна могут быть исключены из количественного определения) , а также различия в алгоритмах программного обеспечения и, следовательно, тенденции анализа
Созданные списки выбора можно использовать для автоматического расщепления белковых пятен в геле и последующей идентификации белков с помощью масс-спектрометрии . Масс-спектрометрический анализ может выявить точные измерения массы наряду с секвенированием пептидов в диапазоне 1000–4000 атомных единиц массы. [9]
Обзор современного подхода к программному анализу изображений геля 2DE см. в Berth et al. [10] или Bandow et al. [11]
^ Клозе, Дж (1975). «Картирование белков с помощью комбинированного изоэлектрического фокусирования и электрофореза тканей мыши. Новый подход к тестированию индуцированных точковых мутаций у млекопитающих» . Гумангенетика . 26 (3): 231–43. дои : 10.1007/bf00281458. PMID 1093965. S2CID 30981877.
^ Свитцер RC 3-й, Меррил CR, Шифрин С (1979). «Высокочувствительная окраска серебром для обнаружения белков и пептидов в полиакриламидных гелях». Аналитическая биохимия . 98 (1): 231–37. дои : 10.1016/0003-2697(79)90732-2. ПМИД 94518.
^ Миккельсен, Сьюзен; Кортон, Эдуардо (2004). Биоаналитическая химия . John Wiley & Sons, Inc. с. 224. ИСБН978-0-471-62386-1.
^ Арора П.С., Ямагива Х., Шривастава А., Боландер М.Э., Саркар Г. (2005). «Сравнительная оценка двух программных приложений для анализа изображений двумерного гель-электрофореза с использованием синовиальной жидкости пациентов с заболеваниями суставов». Дж. Ортоп Ски . 10 (2): 160–66. дои : 10.1007/s00776-004-0878-0. PMID 15815863. S2CID 45193214.
^ Кан, Юньи; Теханукул, Танасит; Манталарис, Анфанасиос; Надь, Юдит М. (февраль 2009 г.). «Сравнение трех коммерчески доступных пакетов программного обеспечения для анализа DIGE: минимальное вмешательство пользователя в протеомику на основе геля». Журнал исследований протеома . 8 (2): 1077–1084. дои : 10.1021/pr800588f. ISSN 1535-3893. ПМИД 19133722.
^ Педрески Р., Хертог М.Л., Карпентье С.С. и др. (апрель 2008 г.). «Обработка пропущенных значений для многомерного статистического анализа данных протеомики на основе геля». Протеомика . 8 (7): 1371–83. дои : 10.1002/pmic.200700975. hdl : 1942/8262 . PMID 18383008. S2CID 21152053.
^ Что такое пропущенные значения и почему они представляют собой проблему?
^ Лепедда, Антонио Дж. и Марилена Формато. «Применение технологии двумерного электрофореза для изучения атеросклероза». EJIFCC том. 19,3 146–159. 20 декабря 2008 г.
^ Берт М., Мозер Ф.М., Кольбе М., Бернхардт Дж. (октябрь 2007 г.). «Современное состояние анализа двумерных изображений гель-электрофореза». Прил. Микробиол. Биотехнология . 76 (6): 1223–43. дои : 10.1007/s00253-007-1128-0. ПМК 2279157 . ПМИД 17713763.
^ Бандоу Дж. Э., Бейкер Дж. Д., Берт М. и др. (август 2008 г.). «Улучшенный рабочий процесс анализа изображений для двумерных гелей позволяет проводить крупномасштабные двухмерные протеомные исследования на основе гелей - исследование по обнаружению биомаркеров ХОБЛ». Протеомика . 8 (15): 3030–41. дои : 10.1002/pmic.200701184. PMID 18618493. S2CID 206361897.
