Дендротоксины — это класс пресинаптических нейротоксинов , вырабатываемых змеями мамба ( Dendroaspis ), которые блокируют определенные подтипы потенциалзависимых калиевых каналов в нейронах , тем самым усиливая высвобождение ацетилхолина в нервно-мышечных соединениях . Благодаря своей высокой активности и селективности к калиевым каналам дендротоксины оказались чрезвычайно полезными в качестве фармакологических инструментов для изучения структуры и функции этих белков ионных каналов .
Было показано, что дендротоксины блокируют определенные подтипы потенциалзависимых калиевых (K + ) каналов в нейронной ткани. [1] В нервной системе потенциалзависимые K + каналы контролируют возбудимость нервов и мышц, контролируя мембранный потенциал покоя и реполяризуя мембрану во время потенциалов действия . Было показано, что дендротоксин связывает перехваты Ранвье двигательных нейронов [2] и блокирует активность этих калиевых каналов. Таким образом, дендротоксины продлевают продолжительность потенциалов действия и увеличивают высвобождение ацетилхолина в нервно-мышечном соединении, что может привести к мышечной гипервозбудимости и судорожным симптомам.
Дендротоксины представляют собой белки массой ~7 кДа, состоящие из одной пептидной цепи, состоящей примерно из 57-60 аминокислот . Было выделено несколько гомологов альфа-дендротоксина, все из которых обладают немного отличающейся последовательностью. Однако молекулярная архитектура и конформация сворачивания этих белков очень похожи. Дендротоксины обладают очень короткой 3 10 -спиралью вблизи N-конца пептида, в то время как двухвитковая альфа-спираль находится вблизи C-конца . Двухцепочечный антипараллельный β-слой занимает центральную часть молекулярной структуры. Эти две β-нити соединены искаженной областью β-поворота [3] , которая, как считается, важна для связывающей активности белка. Все дендротоксины сшиты тремя дисульфидными мостиками , которые добавляют белку стабильность и вносят большой вклад в его структурную конформацию. Остатки цистеина , образующие эти дисульфидные связи, сохранились у всех членов семейства дендротоксинов и расположены в положениях C7–C57, C16–C40 и C32–C53 (нумерация в соответствии с альфа-дендротоксином).
Дендротоксины структурно гомологичны ингибиторам сериновой протеазы типа Кунитца , включая бычий панкреатический ингибитор трипсина (BPTI). Было показано, что альфа-дендротоксин и BPTI имеют 35% идентичности последовательностей, а также идентичные дисульфидные связи. Несмотря на структурную гомологию между этими двумя белками, дендротоксины, по-видимому, не проявляют какой-либо измеримой ингибиторной протеазной активности, как BPTI. Эта потеря активности, по-видимому, является результатом отсутствия ключевых аминокислотных остатков, которые вызывают структурные различия, препятствующие ключевым взаимодействиям, необходимым для активности протеазы, наблюдаемой в BPTI.
Дендротоксины — это основные белки, которые обладают чистым положительным зарядом при наличии в нейтральном pH . Большинство положительно заряженных аминокислотных остатков дендротоксинов расположены в нижней части структуры, создавая катионный домен на одной стороне белка. Положительный заряд возникает из-за остатков лизина (Lys) и аргинина (Arg), которые сосредоточены в трех основных областях белка: около N-конца (Arg3, Arg4, Lys5), около C-конца (Arg54, Arg55) и в узкой области β-поворота (Lys28, Lys29, Lys30). [4] Считается, что эти положительно заряженные остатки могут играть решающую роль в связывающей активности дендротоксина, поскольку они могут взаимодействовать с анионными сайтами (отрицательно заряженными аминокислотами) в порах калиевых каналов.
Одна молекула дендротоксина обратимо связывается с калиевым каналом, чтобы оказать свое ингибирующее действие. Предполагается, что это взаимодействие опосредовано электростатическими взаимодействиями между положительно заряженными аминокислотными остатками в катионном домене дендротоксина и отрицательно заряженными остатками в поре ионного канала . Считается, что калиевые каналы, подобно другим катион-селективным каналам, имеют облако отрицательных зарядов, которые предшествуют открытию поры канала, что помогает проводить ионы калия через путь проникновения. Обычно считается (хотя и не доказано), что молекулы дендротоксина связываются с анионными участками вблизи внеклеточной поверхности канала и физически закупоривают пору, тем самым предотвращая ионную проводимость. Однако Имреди и МакКиннон [5] предположили, что дельта-дендротоксин может иметь нецентральный сайт связывания на своих целевых белках и может ингибировать канал, изменяя структуру канала, а не физически блокируя пору.
Во многих исследованиях предпринимались попытки определить, какие аминокислотные остатки важны для связывающей активности дендротоксинов с их целевыми калиевыми каналами. Харви и др. [6] использовали модификации, специфичные для остатков, для идентификации положительно заряженных остатков, которые имеют решающее значение для блокирующей активности дендротоксина-I. Они сообщили, что ацетилирование Lys5 вблизи N-концевой области и Lys29 в области бета-поворота привело к существенному снижению сродства связывания DTX-I. Аналогичные результаты были показаны с дендротоксином-K с использованием направленного мутагенеза для замены положительно заряженных остатков лизина и аргинина на нейтральные аланины . Эти результаты, наряду со многими другими, подразумевают, что положительно заряженные лизины в N-концевой половине, особенно Lys5 в 3 10 -спирали, играют очень важную роль в связывании дендротоксина с их целевыми калиевыми каналами. Остатки лизина в области β-поворота дали более запутанные результаты, по-видимому, биологически критические в некоторых гомологах дендротоксина и необязательные для других. Более того, мутация всего триплета лизина (K28-K29-K30) в Ala-Ala-Gly в альфа-DTX привела к очень небольшому изменению биологической активности.
Существует общее согласие, что консервативный остаток лизина вблизи N-конца (Lys5 в альфа-DTX) имеет решающее значение для биологической активности всех дендротоксинов, в то время как дополнительные остатки, такие как остатки в области бета-поворота, могут играть роль в специфичности дендротоксина, опосредуя взаимодействия отдельных токсинов с их индивидуальными целевыми сайтами. Это не только помогает объяснить строгую специфичность некоторых дендротоксинов для различных подтипов потенциалзависимых каналов K + , но и объясняет различия в эффективности дендротоксинов для общих каналов K + . Например, Ван и др. [7] показали, что взаимодействие дендротоксина-K с K V 1.1 опосредовано его остатками лизина как в N-конце, так и в области β-поворота, в то время как альфа-дендротоксин, по-видимому, взаимодействует со своей целью исключительно через N-конец. Этот менее обширный интерактивный домен может помочь объяснить, почему альфа-дендротоксин менее дискриминативен, в то время как дендротоксин-К строго избирателен для K V 1.1.
Калиевые каналы нейронов позвоночных демонстрируют высокую степень разнообразия, что позволяет нейронам точно настраивать свои электрические сигнальные свойства путем экспрессии различных комбинаций субъединиц калиевых каналов. Кроме того, поскольку они регулируют ионный поток через биологические мембраны, они важны во многих аспектах клеточной регуляции и передачи сигналов различных типов клеток. Поэтому потенциалзависимые калиевые каналы являются мишенями для широкого спектра мощных биологических токсинов из таких организмов, как змеи, скорпионы , морские анемоны и конусные улитки . Таким образом, очистка яда привела к выделению пептидных токсинов, таких как дендротоксины, которые стали полезными фармакологическими инструментами для изучения калиевых каналов. Благодаря своей эффективности и селективности к различным подтипам калиевых каналов дендротоксины стали полезными в качестве молекулярных зондов для структурного и функционального изучения этих белков. Это может помочь улучшить наше понимание ролей, которые играют отдельные типы каналов, а также помочь в фармакологической классификации этих различных типов каналов. [8] Кроме того, наличие радиоактивно меченых дендротоксинов дает инструмент для скрининга других источников в поисках новых токсинов калиевых каналов, таких как класс каликлудина токсинов калиевых каналов в морских анемонах. Наконец, структурная информация, предоставляемая дендротоксинами, может дать ключи к синтезу терапевтических соединений, которые могут быть нацелены на определенные классы калиевых каналов. Дендротоксин I также использовался для очистки и характеристики белка канала K+, с которым он связывается, с помощью различных методов анализа связывания и хроматографии. [9]