Первое выделение дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) было сделано в 1869 году Фридрихом Мишером . [1] Экстракция ДНК — это процесс выделения ДНК из клеток организма, выделенных из образца, обычно биологического образца, такого как кровь, слюна или ткань. Он включает в себя взлом клеток, удаление белков и других загрязнений, а также очистку ДНК от других клеточных компонентов. Очищенную ДНК затем можно использовать для дальнейших применений, таких как ПЦР , [2] секвенирование или клонирование . В настоящее время это рутинная процедура в молекулярной биологии или судебно-медицинской экспертизе.
Этот процесс можно осуществить несколькими способами, в зависимости от типа образца и последующего применения. [3] Наиболее распространенными методами являются: механический, химический и ферментативный лизис, осаждение, очистка и концентрирование. Конкретный метод, используемый для извлечения ДНК, такой как фенол-хлороформная экстракция, осаждение спиртом или очистка на основе диоксида кремния. [4]
При использовании химического метода для экстракции используется множество различных наборов, и выбор правильного из них сэкономит время на оптимизации набора и процедурах экстракции. Считается, что определение чувствительности ПЦР показывает различия между коммерческими наборами. [5]
Существует множество различных методов извлечения ДНК, но некоторые общие этапы включают в себя:
Стоит отметить, что некоторые варианты этих шагов могут использоваться в зависимости от конкретного протокола выделения ДНК. Кроме того, на рынке имеются некоторые наборы, включающие реагенты и протоколы, специально разработанные для конкретного типа проб. [6]
Экстракция ДНК часто является предварительным этапом во многих диагностических процедурах, используемых для идентификации вирусов и бактерий из окружающей среды, а также диагностики заболеваний и наследственных заболеваний. Эти методы включают, помимо прочего:
Метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) был разработан в 1980-х годах. Основная идея состоит в том, чтобы использовать зонд нуклеиновой кислоты для гибридизации ядерной ДНК либо из интерфазных клеток, либо из метафазных хромосом, прикрепленных к предметному стеклу. Это молекулярный метод, используемый, среди прочего, для распознавания и подсчета определенных групп бактерий. [1]
Чтобы распознать, определить и количественно оценить географические и временные закономерности в сообществах морского бактериопланктона, исследователи используют метод, называемый полиморфизмом длины терминального рестрикционного фрагмента (T-RFLP).
Секвенирование: полные или частичные геномы и другие хромосомные компоненты, завершенные для сравнения с ранее опубликованными последовательностями.
[7]
Клеточные и гистоновые белки, связанные с ДНК, можно удалить либо добавлением протеазы , либо осаждением белков ацетатом натрия или аммония , либо экстрагированием их смесью фенола и хлороформа перед осаждением ДНК.
После выделения ДНК растворяют в слабощелочном буфере, обычно в ТЕ-буфере , или в сверхчистой воде .
Наиболее распространенные химические вещества, используемые для выделения ДНК, включают:
Некоторые из наиболее распространенных методов экстракции ДНК включают органическую экстракцию , экстракцию Chelex и твердофазную экстракцию . [8] Эти методы последовательно дают изолированную ДНК, но они различаются как по качеству, так и по количеству полученной ДНК. При выборе метода выделения ДНК необходимо учитывать множество факторов, включая стоимость, время, безопасность и риск загрязнения.
Органическая экстракция включает добавление инкубации в нескольких различных химических растворах; [8] включая стадию лизиса , фенол-хлороформную экстракцию, осаждение этанолом и стадии промывки. Органическую экстракцию часто используют в лабораториях, поскольку она дешева и дает большое количество чистой ДНК. Хотя это легко, требуется много шагов, и это занимает больше времени, чем другие методы. Это также предполагает неблагоприятное использование токсичных химикатов фенола и хлороформа , а также существует повышенный риск заражения из-за переноса ДНК между несколькими пробирками. [9] Несколько протоколов, основанных на органической экстракции ДНК, были эффективно разработаны десятилетия назад, [10] хотя в последние годы также были разработаны и опубликованы улучшенные и более практичные версии этих протоколов. [11]
Метод экстракции хелекса включает добавление смолы Chelex к образцу, кипячение раствора, затем его встряхивание и центрифугирование. Клеточные материалы связываются с гранулами Chelex, а ДНК доступна в супернатанте . [9] Метод Chelex намного быстрее и проще, чем органическая экстракция, и для него требуется только одна пробирка, что снижает риск загрязнения ДНК. К сожалению, экстракция Chelex не дает такого большого количества, и полученная ДНК является одноцепочечной, что означает, что ее можно использовать только для анализа на основе ПЦР , а не для ПДРФ . [9]
Твердофазная экстракция , например, с использованием метода экстракции на спин-колонке, использует тот факт, что ДНК связывается с кремнеземом . Образец, содержащий ДНК, добавляют в колонку, содержащую силикагель или шарики силикагеля и хаотропные соли. Хаотропные соли разрушают водородные связи между цепями и облегчают связывание ДНК с кремнеземом, заставляя нуклеиновые кислоты становиться гидрофобными. Это обнажает остатки фосфатов и делает их доступными для адсорбции. [12] ДНК связывается с диоксидом кремния, а остальная часть раствора вымывается этанолом для удаления хаотропных солей и других ненужных компонентов. [8] Затем ДНК можно регидратировать водными растворами с низким содержанием соли, что позволяет элюировать ДНК из шариков.
Этот метод позволяет получить высококачественную, в основном двухцепочечную ДНК, которую можно использовать как для ПЦР , так и для ПДРФ- анализа. Эта процедура может быть автоматизирована [9] и имеет высокую производительность, хотя и меньшую, чем фенол-хлороформный метод . Это одноэтапный метод, т.е. вся процедура выполняется в одной пробирке. Это снижает риск заражения, что делает его очень полезным для судебно-медицинской экспертизы ДНК. Различные коммерческие наборы для твердофазной экстракции производятся и продаются различными компаниями; единственная проблема в том, что они дороже, чем органическая экстракция или экстракция Chelex.
Для выделения ДНК из некоторых образцов необходимо выбрать конкретные методы. Типичными образцами со сложным выделением ДНК являются:
Внехромосомную ДНК, как правило, легко выделить, особенно плазмиды можно легко выделить путем лизиса клеток с последующим осаждением белков, которое улавливает хромосомную ДНК в нерастворимой фракции, а после центрифугирования плазмидную ДНК можно очистить от растворимой фракции.
Экстракция ДНК Hirt — это выделение всей внехромосомной ДНК в клетке млекопитающего. Процесс экстракции Hirt избавляет от высокомолекулярной ядерной ДНК , оставляя только низкомолекулярную митохондриальную ДНК и любые вирусные эписомы, присутствующие в клетке.
Индикатор дифениламин (ДФА) подтвердит наличие ДНК. Эта процедура включает химический гидролиз ДНК: при нагревании (например, ≥95 °C) в кислоте реакция требует сахара дезоксирибозы и, следовательно, специфична для ДНК. В этих условиях 2-дезоксирибоза превращается в w-гидроксилевулиниловый альдегид, который реагирует с соединением дифениламином с образованием соединения синего цвета. Концентрацию ДНК можно определить путем измерения интенсивности поглощения раствора при длине волны 600 нм с помощью спектрофотометра и сравнения со стандартной кривой известных концентраций ДНК.
Измерение интенсивности поглощения раствора ДНК на длинах волн 260 и 280 нм используется в качестве меры чистоты ДНК. ДНК можно определить количественно, разрезая ДНК ферментом рестрикции , прогоняя ее на агарозном геле , окрашивая бромидом этидия (EtBr) или другим красителем и сравнивая интенсивность ДНК с ДНК-маркером известной концентрации.
Используя метод Саузерн-блоттинга , эту количественную ДНК можно выделить и дополнительно изучить с помощью ПЦР и ПДРФ- анализа. Эти процедуры позволяют дифференцировать повторяющиеся последовательности внутри генома. Именно эти методы судебно-медицинские эксперты используют для сравнения, идентификации и анализа.
В этом методе ядра растений изолируются путем физического измельчения тканей и восстановления неповрежденных ядер в уникальном буфере для ядерной изоляции (NIB). Пластидные ДНК высвобождаются из органелл и удаляются осмотическим буфером путем промывания и центрифугирования. Очищенные ядра затем лизируют и дополнительно очищают органической экстракцией, а геномную ДНК осаждают высокой концентрацией ЦТАБ. Высокочистая, высокомолекулярная гДНК извлекается из ядер и растворяется в буфере с высоким pH, что обеспечивает стабильное длительное хранение. [14]
Хранение ДНК является важным аспектом проектов по выделению ДНК, поскольку оно обеспечивает целостность и стабильность извлеченной ДНК для последующих применений. [15]
Одним из распространенных методов хранения ДНК является осаждение этанолом, которое включает добавление этанола и соли, такой как хлорид натрия или ацетат калия, к экстрагированной ДНК для осаждения ее из раствора. Затем ДНК осаждают центрифугированием и промывают 70% этанолом для удаления оставшихся примесей. Затем осадок ДНК сушат на воздухе и ресуспендируют в буфере, таком как буфер Трис-ЭДТА (ТЕ), для хранения.
Другой метод — замораживание ДНК в буфере, таком как буфер TE, или в криопротекторе, таком как глицерин или ДМСО, при -20 или -80 градусах Цельсия. Этот метод сохраняет целостность ДНК и замедляет активность любых ферментов, которые могут ее разрушить.
Важно отметить, что выбор буфера и условий хранения будет зависеть от последующего применения, для которого предназначена ДНК. Например, если ДНК будет использоваться для ПЦР, ее можно хранить в буфере ТЕ при температуре 4 градуса Цельсия, а если ее планируется использовать для длительного хранения или транспортировки, ее можно хранить в этаноле при -20 градусах Цельсия. Цельсия. Извлеченную ДНК следует регулярно проверять на ее качество и целостность, например, с помощью гель-электрофореза или спектрофотометрии. Следует также учитывать и контролировать условия хранения, такие как температура и влажность.
Также важно учитывать долгосрочную стабильность ДНК и возможность ее деградации с течением времени. Экстрагированную ДНК следует хранить как можно более короткое время, а условия хранения следует выбирать так, чтобы свести к минимуму риск деградации.
Как правило, экстрагированную ДНК следует хранить в наилучших возможных условиях, чтобы обеспечить ее стабильность и целостность для последующих применений.
Для обеспечения качества выделенной ДНК используется несколько методов контроля качества, в том числе: [16]
{{cite book}}: CS1 maint: отсутствует местоположение издателя ( ссылка )
Текст был скопирован из этого источника, который доступен по международной лицензии Creative Commons Attribution 4.0.{{cite journal}}: Требуется цитировать журнал |journal=( помощь )