stringtranslate.com

Ионная хроматография

Современная система ионной хроматографии

Ионная хроматография (или ионообменная хроматография ) — это форма хроматографии , которая разделяет ионы и ионизируемые полярные молекулы на основе их сродства к ионообменнику . [1] Он работает практически с любыми заряженными молекулами , включая небольшие неорганические анионы, [2] большие белки , [3] маленькие нуклеотиды , [4] и аминокислоты . Однако ионную хроматографию необходимо проводить в условиях, которые отличаются на одну единицу pH от изоэлектрической точки белка. [5]

Двумя типами ионной хроматографии являются анионообменная и катионообменная. Катионообменную хроматографию используют, когда интересующая молекула заряжена положительно. Молекула заряжена положительно, поскольку pH для хроматографии меньше, чем pI (также известный как pH(I)). [6] В этом типе хроматографии неподвижная фаза заряжена отрицательно, а положительно заряженные молекулы притягиваются к ней. Анионообменная хроматография – это когда неподвижная фаза заряжена положительно, а отрицательно заряженные молекулы (это означает, что pH для хроматографии больше, чем pI) загружаются и притягиваются к ней. [7] Его часто используют для очистки белков, анализа воды, [8] [9] и контроля качества. Водорастворимые и заряженные молекулы, такие как белки, аминокислоты и пептиды, связываются с фрагментами , которые имеют противоположный заряд, образуя ионные связи с нерастворимой неподвижной фазой. [10] Уравновешенная стационарная фаза состоит из ионизируемой функциональной группы, с которой целевые молекулы смеси, подлежащей разделению и количественному определению, могут связываться при прохождении через колонку: катионная стационарная фаза используется для разделения анионов, а анионная стационарная фаза используется для разделения анионов. отдельные катионы. Катионообменная хроматография используется, когда желаемыми молекулами для разделения являются катионы, а анионообменная хроматография используется для разделения анионов. [11] Связанные молекулы затем можно элюировать и собирать с помощью элюента, содержащего анионы и катионы, пропуская через колонку более высокую концентрацию ионов или изменяя pH колонки .

Одним из основных преимуществ использования ионной хроматографии является то, что при разделении участвует только одно взаимодействие, в отличие от других методов разделения; следовательно, ионная хроматография может иметь более высокую устойчивость к матрице. Еще одним преимуществом ионного обмена является предсказуемость характера элюирования (на основе присутствия ионизируемой группы). [12] Например, при использовании катионообменной хроматографии некоторые катионы элюируются первыми, а другие — позже. Местный баланс зарядов всегда поддерживается. Однако при выполнении ионообменной хроматографии есть и недостатки, такие как постоянное развитие метода, что приводит к несогласованности результатов от колонки к колонке. [13] Основным ограничением этого метода очистки является то, что он ограничен ионизируемыми группами. [6]

История

Ионообменная хроматография

Ионная хроматография продвинулась вперед благодаря накоплению знаний в течение многих лет. Начиная с 1947 года Спеддинг и Пауэлл использовали вытесняющую ионообменную хроматографию для разделения редкоземельных элементов. Кроме того, они показали ионообменное разделение изотопов 14N и 15N в аммиаке. В начале 1950-х годов Краус и Нельсон продемонстрировали использование многих аналитических методов для ионов металлов в зависимости от разделения их хлоридных, фторидных, нитратных или сульфатных комплексов с помощью анионной хроматографии. Автоматическое поточное детектирование постепенно внедрялось с 1960 по 1980 год, а также новые хроматографические методы разделения ионов металлов. Инновационный метод Смолла, Стивенса и Баумана из Dow Chemical Co. положил начало созданию современной ионной хроматографии. Анионы и катионы теперь можно было эффективно разделять с помощью системы обнаружения подавленной проводимости. В 1979 году Gjerde et al. представил метод анионной хроматографии с обнаружением неподавленной проводимости. Вслед за ним в 1980 году появился аналогичный метод катионной хроматографии. [14]

В результате на рынке микросхем начался период жесткой конкуренции со сторонниками как обнаружения с подавлением, так и без подавления проводимости . Эта конкуренция привела к быстрому росту новых форм и быстрой эволюции ИС. [15] Задача, которую необходимо решить в будущем развитии ИК, - это подготовка высокоэффективных монолитных ионообменных колонн, и преодоление этой проблемы будет иметь большое значение для развития ИК. [16]

Бум ионообменной хроматографии начался в период с 1935 по 1950 годы во время Второй мировой войны , и именно благодаря « Манхэттенскому проекту » возможности применения ионообменной хроматографии были значительно расширены. Ионная хроматография была первоначально предложена двумя английскими исследователями, сельскохозяйственным сэром Томпсоном и химиком Дж. Т. Уэем. Работы Томпсона и Уэя предусматривали действие водорастворимых солей удобрений, сульфата аммония и хлорида калия. Эти соли невозможно было легко извлечь из земли из-за дождя. Они применили ионные методы обработки глин солями, что привело к извлечению аммиака в дополнение к высвобождению кальция. [17] [ ненадежный источник? ] В пятидесятых и шестидесятых годах были разработаны теоретические модели ИК для дальнейшего понимания, и только в семидесятые годы стали использоваться детекторы непрерывного действия, проложившие путь к развитию от хроматографии низкого давления к высокоэффективной хроматографии. Лишь в 1975 году слово «ионная хроматография» стало названием этого метода, а затем использовалось в качестве названия в маркетинговых целях. Сегодня ИК важен для исследования водных систем, таких как питьевая вода. Это популярный метод анализа анионных элементов или комплексов, которые помогают решать экологически важные проблемы. Кроме того, он также находит широкое применение в полупроводниковой промышленности. [18]

Из-за большого количества разделительных колонок, элюирующих систем и детекторов хроматография превратилась в основной метод ионного анализа. [19]

Когда этот метод был первоначально разработан, он в основном использовался для очистки воды. С 1935 года ионообменная хроматография быстро превратилась в один из наиболее широко используемых методов, принципы которого часто применяются в большинстве областей химии, включая дистилляцию, адсорбцию и фильтрацию. [20]

Принцип

Ионная хроматограмма, показывающая разделение анионов

Ионообменная хроматография разделяет молекулы по их соответствующим заряженным группам. Ионообменная хроматография удерживает молекулы аналита на колонке за счет кулоновских (ионных) взаимодействий. Матрица ионообменной хроматографии состоит из положительно и отрицательно заряженных ионов. [21] По сути, молекулы подвергаются электростатическому взаимодействию с противоположными зарядами на матрице неподвижной фазы. Неподвижная фаза состоит из неподвижной матрицы, содержащей заряженные ионизируемые функциональные группы или лиганды . [22] На поверхности неподвижной фазы присутствуют ионные функциональные группы (RX), которые взаимодействуют с ионами аналита противоположного заряда. Для достижения электронейтральности эти иммобилизованные заряды соединяются с обменными противоионами в растворе. Ионизируемые молекулы, подлежащие очистке, конкурируют с этими обменными противоионами за связывание с иммобилизованными зарядами на неподвижной фазе. Эти ионизируемые молекулы сохраняются или элюируются в зависимости от их заряда. Первоначально в первую очередь вымываются молекулы, которые не связываются или слабо связываются с неподвижной фазой. Для элюирования молекул, связывающихся с неподвижной фазой, необходимы измененные условия. Концентрацию обменных противоионов, которые конкурируют с молекулами за связывание, можно увеличить или изменить pH, чтобы повлиять на ионный заряд элюента или растворенного вещества. Изменение pH влияет на заряд конкретных молекул и, следовательно, изменяет их связывание. При уменьшении чистого заряда молекул растворенного вещества они начинают элюироваться. Таким образом, такие корректировки можно использовать для высвобождения интересующих белков. Кроме того, концентрацию противоионов можно постепенно изменять, чтобы повлиять на удержание ионизированных молекул и тем самым разделить их. Этот тип элюирования называется градиентным элюированием. С другой стороны, можно использовать ступенчатое элюирование, при котором ступенчато варьируют концентрацию противоионов. [5] Этот тип хроматографии далее подразделяется на катионообменную хроматографию и анионообменную хроматографию . Положительно заряженные молекулы связываются с катионообменными смолами, а отрицательно заряженные молекулы связываются с анионообменными смолами. [23] Ионное соединение, состоящее из катионных частиц M+ и анионных частиц B-, может удерживаться неподвижной фазой.

Катионообменная хроматография сохраняет положительно заряженные катионы , поскольку в неподвижной фазе присутствует отрицательно заряженная функциональная группа:

Анионообменная хроматография удерживает анионы с помощью положительно заряженной функциональной группы:

Обратите внимание, что ионную силу C+ или A- в подвижной фазе можно регулировать для смещения положения равновесия и, следовательно, времени удерживания.

Ионная хроматограмма представляет собой типичную хроматограмму, полученную на анионообменной колонке.

Процедура

Прежде чем приступить к ионообменной хроматографии, ее необходимо уравновесить. Неподвижная фаза должна быть приведена в равновесие с определенными требованиями, которые зависят от эксперимента, над которым вы работаете. После достижения равновесия заряженные ионы в неподвижной фазе присоединятся к противоположно заряженным обменным ионам, таким как Cl- или Na+. Далее следует выбрать буфер, с которым может связываться желаемый белок. После уравновешивания колонку необходимо промыть. Фаза промывания поможет элюировать все примеси, которые не связываются с матрицей, в то время как интересующий белок остается связанным. Этот буфер для образца должен иметь тот же pH, что и буфер, используемый для уравновешивания, чтобы помочь связывать нужные белки. Незаряженные белки будут элюироваться из колонки с той же скоростью, что и буфер, протекающий через колонку, без удержания. После того как образец загружен в колонку и колонка промыта буфером для элюирования всех нежелательных белков, элюирование проводится при определенных условиях для элюирования желаемых белков, связанных с матрицей. Связанные белки элюируются с использованием градиента линейно возрастающей концентрации соли. С увеличением ионной силы буфера ионы соли будут конкурировать с нужными белками за связывание с заряженными группами на поверхности среды. Это приведет к элюированию желаемых белков из колонки. Белки с низким суммарным зарядом будут элюироваться первыми, поскольку концентрация соли увеличивается, что приводит к увеличению ионной силы. Белкам с высоким суммарным зарядом потребуется более высокая ионная сила, чтобы они могли элюироваться из колонки. [21]

Ионообменную хроматографию можно проводить в массе, на тонких слоях среды, например, на стеклянных или пластиковых пластинках, покрытых слоем желаемой неподвижной фазы, или на хроматографических колонках. Тонкослойная хроматография или колоночная хроматография имеют сходство в том, что обе они действуют в рамках одних и тех же руководящих принципов; происходит постоянный и частый обмен молекул по мере движения подвижной фазы вдоль неподвижной фазы. Нет необходимости добавлять образец в небольших объемах, поскольку заданные условия для обменной колонки выбраны таким образом, чтобы между подвижной и неподвижной фазами было сильное взаимодействие. Более того, механизм процесса элюирования будет вызывать разделение различных молекул на основе их соответствующих химических характеристик. Это явление происходит из-за увеличения концентрации соли в верхней части колонны или вблизи нее, тем самым вытесняя молекулы в этом положении, в то время как молекулы, связанные ниже, высвобождаются позже, когда более высокая концентрация соли достигает этой области. Эти принципы являются причинами того, что ионообменная хроматография является отличным кандидатом на начальные этапы хроматографии в сложной процедуре очистки, поскольку она может быстро давать небольшие объемы целевых молекул независимо от большего исходного объема. [6]

Камера (слева) содержит высокую концентрацию соли. Камера с перемешиванием (справа) содержит низкую концентрацию соли. Постепенное перемешивание приводит к образованию градиента соли по мере перемещения соли от высоких концентраций к низким.

Сравнительно простые устройства часто используются для подачи противоионов возрастающего градиента в хроматографическую колонку. Противоионы, такие как медь (II), чаще всего выбирают для эффективного разделения пептидов и аминокислот посредством образования комплексов. [24]

Для создания градиента соли можно использовать простое устройство. Буфер для элюирования последовательно вытягивается из камеры в камеру смешивания, тем самым изменяя концентрацию буфера. Обычно буфер, помещенный в камеру, обычно имеет высокую начальную концентрацию, тогда как буфер, помещенный в камеру с перемешиванием, обычно имеет низкую концентрацию. По мере того как буфер высокой концентрации из левой камеры смешивается и втягивается в колонку, концентрация буфера в перемешиваемой колонке постепенно увеличивается. Изменение формы камеры перемешивания, а также предельного буфера позволяет создавать вогнутые, линейные или выпуклые градиенты противоиона.

Для стационарной фазы используется множество различных сред. Среди наиболее часто используемых иммобилизованных заряженных групп - триметиламиноэтил (ТАМ), триэтиламиноэтил (TEAE), диэтил-2-гидроксипропиламиноэтил (QAE), аминоэтил (AE), диэтиламиноэтил (DEAE), сульфо (S), сульфометил (SM), сульфопропил ( SP), карбокси (C) и карбоксиметил (CM). [5]

Успешная упаковка колонки — важный аспект ионной хроматографии. Стабильность и эффективность конечной колонки зависит от методов набивки, используемого растворителя и факторов, влияющих на механические свойства колонки. В отличие от ранних неэффективных методов сухой упаковки, влажная суспензионная насадка, при которой частицы, суспендированные в соответствующем растворителе, подаются в колонку под давлением, демонстрирует значительные улучшения. При упаковке влажной суспензии можно использовать три различных подхода: метод сбалансированной плотности (плотность растворителя примерно равна плотности частиц пористого кремнезема), метод высокой вязкости (используется растворитель высокой вязкости) и метод суспензии низкой вязкости (осуществляется с растворителями низкой вязкости). [25]

Полистирол используется в качестве среды для ионного обмена. Его производят путем полимеризации стирола с использованием дивинилбензола и пероксида бензоила. Такие обменники образуют с белками гидрофобные взаимодействия, которые могут быть необратимыми. Из-за этого свойства полистироловые ионообменники не подходят для разделения белков. С другой стороны, они используются для разделения небольших молекул при разделении аминокислот и удалении солей из воды. Полистирольные ионообменники с большими порами можно использовать для разделения белка, но они должны быть покрыты гидрофильным веществом. [26]

Среду на основе целлюлозы можно использовать для разделения крупных молекул, поскольку они содержат большие поры. Связывание с белками в этой среде высокое и имеет низкую гидрофобность. DEAE представляет собой анионообменную матрицу, которая производится из положительной боковой группы диэтиламиноэтила, связанной с целлюлозой или сефадексом. [27]

Среда на основе агарозного геля также содержит крупные поры, но их замещающая способность ниже по сравнению с декстранами. Способность среды набухать в жидкости основана на сшивании этих веществ, pH и концентрации ионов используемых буферов. [26]

Введение высокой температуры и давления позволяет значительно повысить эффективность ионной хроматографии наряду с сокращением времени. Температура оказывает влияние на селективность из-за ее влияния на свойства удерживания. Коэффициент удерживания ( k = ( t R g − t M g )/( t M g − t ext )) увеличивается с температурой для малых ионов, а для более крупных ионов наблюдается противоположная тенденция. [28] [29]

Несмотря на ионную селективность в различных средах, проводятся дальнейшие исследования по проведению ионообменной хроматографии в диапазоне 40–175 °C. [30]

Подходящий растворитель можно выбрать на основе наблюдений за поведением частиц колонки в растворителе. С помощью оптического микроскопа можно легко отличить желаемое дисперсное состояние суспензии от агрегированных частиц. [25]

Слабые и сильные ионообменники.

«Сильный» ионообменник не потеряет заряд своей матрицы после того, как колонка будет уравновешена, поэтому можно использовать широкий диапазон буферов pH. «Слабые» ионообменники имеют диапазон значений pH, в котором они сохраняют свой заряд. Если pH буфера, используемого для колонки со слабым ионообменом, выходит за пределы емкости матрицы, колонка потеряет распределение заряда и интересующая молекула может быть потеряна. [31] Несмотря на меньший диапазон pH слабых ионообменников, их часто используют вместо сильных ионообменников из-за их большей специфичности. В некоторых экспериментах время удерживания слабых ионообменников достаточно велико для получения желаемых данных с высокой специфичностью. [32]

Смолы (часто называемые «шариками») ионообменных колонок могут включать функциональные группы, такие как слабые/сильные кислоты и слабые/сильные основания. Существуют также специальные колонки, содержащие смолы с амфотерными функциональными группами, способными обменивать как катионы, так и анионы. [33] Некоторыми примерами функциональных групп сильных ионообменных смол являются катион четвертичного аммония (Q), который является анионообменником, и сульфоновая кислота (S, -SO 2 OH), которая является катионообменником. [34] Эти типы обменников могут поддерживать плотность заряда в диапазоне pH от 0 до 14. Примеры функциональных групп слабых ионообменных смол включают диэтиламиноэтил (DEAE, -C 2 H 4 N(CH 2 H 5 ) 2 ), который является анионообменником, и карбоксиметил (CM, -CH 2 -COOH), [35] который является катионитом. Эти два типа обменников могут поддерживать плотность заряда своих колонок в диапазоне pH 5–9. [ нужна цитата ]

В ионной хроматографии взаимодействие ионов растворенного вещества и неподвижной фазы в зависимости от их заряда определяет, какие ионы будут связываться и в какой степени. Когда неподвижная фаза содержит положительные группы, притягивающие анионы, ее называют анионообменником; когда в неподвижной фазе есть отрицательные группы, катионы притягиваются, и это катионообменник. [36] Притяжение между ионами и неподвижной фазой также зависит от смолы, органических частиц, используемых в качестве ионообменников.

Каждая смола обладает относительной селективностью, которая варьируется в зависимости от присутствующих ионов растворенного вещества, которые будут конкурировать за связывание с группой смолы в неподвижной фазе. Коэффициент селективности, эквивалентный константе равновесия, определяется через соотношение концентраций смолы и каждого иона, однако общая тенденция такова, что ионообменники предпочитают связываться с ионом с более высоким зарядом, меньшим гидратным радиусом и более высокая поляризуемость или способность электронного облака иона разрушаться другими зарядами. [37] Несмотря на эту селективность, избыточное количество иона с более низкой селективностью, введенное в колонку, приведет к тому, что меньший ион будет больше связываться с неподвижной фазой, поскольку коэффициент селективности допускает колебания реакции связывания, которая происходит во время ионообменной хроматографии.

В следующей таблице показаны наиболее часто используемые ионообменники [38]

Типичная техника

Проба вводится вручную или с помощью автосамплера в петлю отбора проб известного объема. Забуференный водный раствор, известный как подвижная фаза , переносит образец из петли в колонку, которая содержит некоторую форму материала неподвижной фазы. Обычно это смоляная или гелевая матрица, состоящая из шариков агарозы или целлюлозы с ковалентно связанными заряженными функциональными группами. Уравновешивание неподвижной фазы необходимо для получения желаемой загрузки колонны. Если колонка не уравновешена должным образом, желаемая молекула может не прочно связываться с колонкой. Целевые аналиты (анионы или катионы) сохраняются в неподвижной фазе, но могут быть элюированы за счет увеличения концентрации частиц с одинаковым зарядом, которые вытесняют ионы аналита из неподвижной фазы. Например, в катионообменной хроматографии положительно заряженное аналит можно заменить добавлением положительно заряженных ионов натрия. Затем интересующие аналиты должны быть обнаружены каким-либо способом, обычно по проводимости или поглощению УФ/видимого света.

Для управления системой IC обычно требуется система хроматографических данных (CDS). В дополнение к системам IC некоторые из этих CDS могут также контролировать газовую хроматографию (ГХ) и ВЭЖХ.

Мембранная обменная хроматография

Разновидность ионообменной хроматографии, мембранный обмен [39] [40] — относительно новый метод очистки, разработанный для преодоления ограничений использования колонок, набитых шариками. Мембранные хроматографические устройства [41] [42] дешевы в массовом производстве и одноразовые, в отличие от других хроматографических устройств, которые требуют обслуживания и времени для повторной проверки. Существует три типа мембранных поглотителей, которые обычно используются при разделении веществ. Три типа: плоский лист, полое волокно и радиальный поток. Наиболее распространенным поглотителем, лучше всего подходящим для мембранной хроматографии, являются несколько плоских листов, поскольку они имеют больший объем поглотителя. Его можно использовать для преодоления ограничений массопереноса [43] и падения давления [44] , что делает его особенно выгодным для выделения и очистки вирусов, плазмидной ДНК и других крупных макромолекул. Колонка заполнена микропористыми мембранами с внутренними порами, содержащими адсорбционные фрагменты, способные связывать целевой белок. Доступны адсорбционные мембраны различной геометрии и химического состава, что позволяет использовать их для очистки, а также фракционирования, концентрирования и осветления с эффективностью, в 10 раз превышающей эффективность использования шариков. [45] Мембраны можно получить путем выделения самой мембраны, где мембраны разрезаются на квадраты и иммобилизуются. Более поздний метод включал использование живых клеток, прикрепленных к опорной мембране и используемых для идентификации и уточнения сигнальных молекул. [46]

Разделение белков

Ионообменная колонка препаративного масштаба, используемая для очистки белков .

Ионообменную хроматографию можно использовать для разделения белков, поскольку они содержат заряженные функциональные группы. Интересующие ионы (в данном случае заряженные белки) заменяются на другие ионы (обычно H + ) на заряженном твердом носителе. Растворенные вещества чаще всего находятся в жидкой фазе, которой обычно является вода. Возьмем, к примеру, белки в воде, которая представляет собой жидкую фазу, пропускаемую через колонку. Колонку обычно называют твердой фазой, поскольку она заполнена пористыми синтетическими частицами, имеющими определенный заряд. Эти пористые частицы также называются шариками, могут быть аминированы (содержат аминогруппы) или иметь ионы металлов, чтобы иметь заряд. Колонку можно приготовить с использованием пористых полимеров, для макромолекул массой более 100 000 Да оптимальный размер пористой частицы составляет около 1 мкм 2 . Это связано с тем, что медленная диффузия растворенных веществ внутри пор не ограничивает качество разделения. [47] Гранулы, содержащие положительно заряженные группы, которые притягивают отрицательно заряженные белки, обычно называют анионообменными смолами. Аминокислоты, имеющие отрицательно заряженные боковые цепи при pH 7 (pH воды), представляют собой глутамат и аспартат. Отрицательно заряженные шарики называются катионообменными смолами, поскольку положительно заряженные белки притягиваются. Аминокислоты с положительно заряженными боковыми цепями при pH 7 — это лизин, гистидин и аргинин. [48]

Изоэлектрическая точка — это уровень pH, при котором соединение (в данном случае белок) не имеет суммарного заряда. Изоэлектрическая точка или PI белка может быть определена с использованием pKa боковых цепей: если амино (положительная цепь) способна нейтрализовать карбоксильную (отрицательную) цепь, белок будет находиться на своем PI. Использование буферов вместо воды для белков, не имеющих заряда при pH 7, является хорошей идеей, поскольку позволяет манипулировать pH для изменения ионных взаимодействий между белками и гранулами. [49] Слабокислотные или основные боковые цепи могут иметь заряд, если pH достаточно высокий или низкий соответственно. Разделение может быть достигнуто на основе естественной изоэлектрической точки белка. Альтернативно, к белку можно генетически добавить пептидную метку, чтобы придать белку изоэлектрическую точку, отличную от большинства природных белков (например, 6 аргининов для связывания с катионообменной смолой или 6 глутаматов для связывания с анионообменной смолой, такой как DEAE). -Сефароза).

Элюирование за счет увеличения ионной силы подвижной фазы является более тонким. Это работает, потому что ионы подвижной фазы взаимодействуют с иммобилизованными ионами неподвижной фазы, таким образом «экранируя» неподвижную фазу от белка и позволяя белку элюироваться.

Элюирование из ионообменных колонок может быть чувствительным к изменению однозарядного заряда – хроматофокусирование . Ионообменная хроматография также полезна при выделении специфических мультимерных белковых сборок, позволяя очищать специфические комплексы как по количеству, так и по положению заряженных пептидных меток. [50] [51]

Эффект Гиббса – Доннана

В ионообменной хроматографии эффект Гиббса–Доннана наблюдается при разнице pH применяемого буфера и ионита даже до одной единицы pH. Например, в анионообменных колонках ионообменники отталкивают протоны, поэтому pH буфера возле колонки отличается выше, чем у остального растворителя. [52] В результате экспериментатор должен следить за тем, чтобы интересующий белок (белки) был стабильным и правильно заряженным при «фактическом» pH.

Этот эффект возникает из-за того, что две одинаково заряженные частицы, одна из смолы, а другая из раствора, не могут должным образом распределиться между двумя сторонами; происходит избирательное поглощение одного иона по сравнению с другим. [53] [54] Например, в сульфированной полистироловой смоле, катионообменной смоле, ион хлора буфера соляной кислоты должен уравновеситься в смоле. Однако, поскольку концентрация сульфоновой кислоты в смоле высока, водород HCl не имеет тенденции попадать в колонну. Это, в сочетании с необходимостью электронейтральности, приводит к тому, что в смолу попадает минимальное количество водорода и хлора. [54]

Использование

Клиническая полезность

Использование ионной хроматографии можно увидеть в хроматографии с серебром . [ нужна цитация ] Обычно серебро и соединения, содержащие ацетиленовые и этиленовые связи, имеют очень слабые взаимодействия. Это явление было широко протестировано на олефиновых соединениях. Ионные комплексы, которые олефины образуют с ионами серебра, слабы и основаны на перекрытии пи-, сигма- и d-орбиталей, поэтому доступные электроны не вызывают реальных изменений в двойной связи. Этим поведением манипулировали для разделения липидов, главным образом жирных кислот, из смесей на фракции с различным числом двойных связей с использованием ионов серебра. Ионные смолы пропитывались ионами серебра, которые затем подвергались воздействию различных кислот (кремниевой кислоты) для элюирования жирных кислот с разными характеристиками.

Для ионов щелочных металлов можно получить пределы обнаружения всего лишь 1 мкМ. [55] Его можно использовать для измерения HbA1c , порфирина и при очистке воды . Ионообменные смолы (ИОС) получили широкое применение, особенно в медицине, благодаря своей высокой емкости и несложной системе процесса разделения. Одним из синтетических применений является использование ионообменных смол для диализа почек. Этот метод используется для разделения элементов крови с помощью искусственной почки с целлюлозной мембраной. [56]

Другое клиническое применение ионной хроматографии заключается в методе быстрой анионообменной хроматографии, используемом для отделения изоферментов креатинкиназы (КК) от сыворотки человека и тканей, полученных из аутопсийного материала (в основном использовались ткани, богатые ЦК, такие как сердечная мышца и мозг). [ нужна цитация ] Эти изоферменты включают MM, MB и BB, которые выполняют одну и ту же функцию с учетом разных аминокислотных последовательностей. Функции этих изоферментов заключаются в преобразовании креатина с использованием АТФ в креатинфосфокреатин, вытесняющий АДФ. Мини-колонки заполняли DEAE-сефадексом А-50 и дополнительно элюировали трис-буфером хлорида натрия в различных концентрациях (каждая концентрация была выбрана преимущественно для управления элюированием). Экстракт человеческой ткани помещали в колонки для разделения. Все фракции были проанализированы для определения общей активности ЦК, и было обнаружено, что каждый источник изоферментов ЦК содержал характерные изоферменты, обнаруженные внутри. Сначала элюировали CK-MM, затем CK-MB, а затем CK-BB. Следовательно, изоферменты, обнаруженные в каждом образце, можно использовать для идентификации источника, поскольку они тканеспецифичны.

Используя информацию, полученную в результате, можно было установить корреляцию между диагнозом пациентов и типом изоферментов ЦК, обнаруживаемых с наибольшей активностью. Согласно полученным данным, около 35 из 71 исследованного пациента, перенесшего сердечный приступ (инфаркт миокарда), также содержали большое количество изоферментов CK-MM и CK-MB. Результаты также показывают, что при многих других диагнозах, включая почечную недостаточность, цереброваскулярные заболевания и заболевания легких, обнаруживается только изофермент CK-MM и никакой другой изофермент. Результаты этого исследования указывают на корреляцию между различными заболеваниями и обнаруженными изоферментами ЦК, что подтверждает результаты предыдущих тестов с использованием различных методов. Исследования CK-MB, обнаруженного у жертв сердечного приступа, расширились после этого исследования и применения ионной хроматографии.

Промышленное применение

С 1975 г. ионная хроматография нашла широкое применение во многих отраслях промышленности. Основными выгодными преимуществами являются надежность, очень хорошая точность и точность, высокая селективность, высокая скорость, высокая эффективность разделения и низкая стоимость расходных материалов. Наиболее значительным достижением, связанным с ионной хроматографией, являются новые методы подготовки проб; повышение скорости и селективности разделения аналитов; снижение пределов обнаружения и пределов количественного определения; расширение сферы применения; разработка новых стандартных методов; миниатюризация и расширение области анализа новой группы веществ. Позволяет проводить количественное тестирование электролита и фирменных добавок гальванических ванн. [57] Это усовершенствование качественного тестирования клеток корпуса или менее точного УФ-тестирования. Ионы, катализаторы, отбеливатели и ускорители можно измерить. [57] Ионообменная хроматография постепенно стала широко известным универсальным методом обнаружения как анионных, так и катионных частиц. Приложения для таких целей были разработаны или находятся в стадии разработки для различных областей интересов, в частности, для фармацевтической промышленности. В последние годы использование ионообменной хроматографии в фармацевтических препаратах возросло, и в 2006 году в Национальный фармакопею США (USP-NF) была официально добавлена ​​глава, посвященная ионообменной хроматографии. Кроме того, в выпуске USP-NF в 2009 году Фармакопея США предоставила несколько анализов ионной хроматографии с использованием двух методов: обнаружения проводимости, а также импульсного амперометрического обнаружения. Большинство этих приложений в основном используются для измерения и анализа остаточных пределов в фармацевтических препаратах, включая определение предельных значений оксалатов, йодидов, сульфатов, сульфаматов, фосфатов, а также различных электролитов, включая калий и натрий. В общей сложности издание USP-NF за 2009 год официально опубликовало двадцать восемь методов обнаружения для анализа активных соединений или компонентов активных соединений с использованием либо обнаружения по проводимости, либо импульсного амперометрического обнаружения. [58]

Разработка лекарств

Система ионной хроматографии, используемая для обнаружения и измерения катионов, таких как натрий, аммоний и калий, в составах отхаркивающих средств от кашля.

Растет интерес к применению ИК для анализа фармацевтических препаратов. IC используется в различных аспектах разработки продукции и тестирования контроля качества. Например, IC используется для улучшения стабильности и растворимости молекул фармацевтических активных лекарств, а также для обнаружения систем, которые имеют более высокую толерантность к органическим растворителям. IC использовался для определения аналитов в рамках теста на растворение. Например, тесты на растворение кальция показали, что другие ионы, присутствующие в среде, могут хорошо разделяться между собой, а также от иона кальция. Поэтому IC используется в лекарствах в форме таблеток и капсул, чтобы определить количество растворяющегося лекарства с течением времени. [59] IC также широко используется для обнаружения и количественного определения наполнителей или неактивных ингредиентов, используемых в фармацевтических составах. Обнаружение сахара и сахарного спирта в таких составах с помощью IC было осуществлено благодаря тому, что эти полярные группы растворялись в ионной колонке. Методика ИК также создана при анализе примесей в лекарственных субстанциях и продуктах. Оцениваются примеси или любые компоненты, которые не являются частью химического состава лекарственного средства, и они дают представление о максимальном и минимальном количестве лекарственного средства, которое следует вводить пациенту в день. [60]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Мунтян, Эдвард (2022). Анализ пищевых продуктов: с помощью ионной хроматографии . Де Грюйтер STEM. Берлин Бостон: Де Грюйтер. ISBN 978-3-11-064440-1.
  2. ^ Нгере, Джудит Б.; Эбрахими, Курош Х.; Уильямс, Рэйчел; Пирес, Элизабете; Уолсби-Тикл, Джон; МакКаллах, Джеймс СО (10 января 2023 г.). «Ионообменная хроматография в сочетании с масс-спектрометрией в науках о жизни, окружающей среде и медицинских исследованиях». Аналитическая химия . 95 (1): 152–166. doi : 10.1021/acs.analchem.2c04298. ISSN  0003-2700. ПМЦ 9835059 . ПМИД  36625129. 
  3. ^ «Ионообменное равновесие», Ионообменная хроматография белков , CRC Press, стр. 121–158, 14 апреля 1988 г., doi : 10.1201/b15751-8, ISBN 9780429173790, получено 13 октября 2023 г.
  4. ^ Сингхал, Рам П. (1974). «Анион-эксклюзионная и анионообменная хроматография нуклеотидов». Европейский журнал биохимии . 43 (2): 245–252. дои : 10.1111/j.1432-1033.1974.tb03406.x . ISSN  0014-2956. ПМИД  4838980.
  5. ^ abc Нинфа, Александр Дж., Дэвид П. Баллоу и Мэрили Бенор (2010). Фундаментальные лабораторные подходы к биохимии и биотехнологии . Хобокен, Нью-Джерси: Джон Уайли
  6. ^ abc Нинфа, Александр; Баллу, Дэвид; Бенор, Мэрили (26 мая 2009 г.). Фундаментальные лабораторные подходы к биохимии и биотехнологии . Уайли. стр. 143–145. ISBN 978-0470087664.
  7. ^ «Принципы ионообменной хроматографии». Separations.us.tosohbioscience.com . Проверено 1 мая 2018 г.
  8. ^ «Справочник по мониторингу промышленных сточных вод». Агентство по охране окружающей среды (США). Август 1973 года . Проверено 30 июля 2016 г.
  9. ^ Домбровский А., Хубицкий З., Подкосцельни П. и Робенс Э. (2004). Селективное удаление ионов тяжелых металлов из вод и промышленных сточных вод ионообменным методом. Хемосфера, 56(2), 91-106.
  10. ^ Лукман, Мохаммад и Инамуддин (2012). Технология ионного обмена II . Спрингер Нидерланды. п. 1. ISBN 978-94-007-4026-6 . 
  11. ^ Фриц, Джеймс С. (1987). «Ионная хроматография». Аналитическая химия . 59 (4): 335А–344А. дои : 10.1021/ac00131a002.
  12. ^ Сигел, Майлз (май 1997 г.). «Быстрая очистка библиотек малых молекул с помощью ионообменной хроматографии». Буквы тетраэдра . 38 (19): 3357–3358. дои : 10.1016/S0040-4039(97)00650-3.
  13. ^ Нойбауэр, Кеннет (ноябрь 2009 г.). «Преимущества и недостатки различных типов колонок для анализа видообразования с помощью LC-ICP-MS». Спектроскопия . Спектроскопия-01.11.2009. 24 (11) . Проверено 9 мая 2016 г.
  14. ^ Фриц, Дж.С. (2004). «Ранние вехи развития ионообменной хроматографии: личный отчет». Журнал хроматографии А. 1039 (1–2): 3–12. дои : 10.1016/s0021-9673(04)00020-2. ПМИД  15250395.
  15. ^ Люси, Калифорния (2003). «Эволюция ионного обмена: от Моисея до Манхэттенского проекта и до наших дней». Журнал хроматографии А. 1000 (1–2): 711–24. дои : 10.1016/s0021-9673(03)00528-4. ПМИД  12877196.
  16. ^ «Последние разработки и новые направления в ионной хроматографии». {{cite journal}}: Требуется цитировать журнал |journal=( помощь )
  17. ^ Эндилонг. «История ионообменной хроматографии». Ионная хроматография . Архивировано из оригинала 24 апреля 2016 года . Проверено 9 мая 2016 г.
  18. ^ Лю, С. Джесси; Ву, Т; Сюй, Х; Хуанг, К. (24 апреля 1998 г.). «Применение ионной хроматографии в полупроводниковой промышленности: I. Измерение кислотных загрязнителей воздуха в чистых помещениях». Журнал хроматографии А. 804 (1): 273–278. дои : 10.1016/S0021-9673(98)00028-4. ISSN  0021-9673. ПМИД  9615406.
  19. ^ Эйт, Клаудия, Колб Максимилиан и Зойберт Андреас (2002). «Введение» в практическую ионную хроматографию. Введение . Эд. Фивегер Кай. Херизау: Метром. п. 160.
  20. ^ Наход, ФК (1940). Ионный обмен: теория и применение . Том. 68. С. 1, 2. Бибкод : 1949SoilS..68S.414.. doi : 10.1097/00010694-194911000-00021. ISBN 978-0124312999. {{cite book}}: |journal=игнорируется ( помощь )
  21. ^ ab Принципы и методы ионообменной хроматографии . Компания Дженерал Электрик. 2004. стр. 11–20.
  22. ^ Юнгбауэр, Алоис; Хан, Райнер (2009). «Глава 22 Ионообменная хроматография». Руководство по очистке белков, 2-е издание . Методы энзимологии. Том. 463. стр. 349–371. дои : 10.1016/S0076-6879(09)63022-6. ISBN 9780123745361. ПМИД  19892182.
  23. ^ Дуонг-Ли, KC; Габелли, С.Б. (2014). «Использование ионообменной хроматографии для очистки рекомбинантно экспрессированного белка». Лабораторные методы в энзимологии: Белок, часть C. Том. 541. С. 95–103. дои : 10.1016/B978-0-12-420119-4.00008-2. ISBN 9780124201194. ПМИД  24674065.
  24. ^ Дитер, Дебра С.; Уолтон, Гарольд Ф. (1 ноября 1983 г.). «Противоионные эффекты в ионообменной распределительной хроматографии». Аналитическая химия . 55 (13): 2109–2112. дои : 10.1021/ac00263a025.
  25. ^ Аб Киркланд, Джей Джей; ДеСтефано, Джей-Джей (8 сентября 2006 г.). «Искусство и наука формирования насадочных аналитических высокоэффективных колонок для жидкостной хроматографии». Журнал хроматографии А. Роль теории в хроматографии. 1126 (1–2): 50–57. doi :10.1016/j.chroma.2006.04.027. ПМИД  16697390.
  26. ^ Аб Янсон, Ян-Кристер. (2011). Очистка белков: принципы, методы высокого разрешения и приложения . Джон Уайли и сыновья.
  27. ^ Лэки, Джон (2010). Словарь биохимии . Издательство Оксфордского университета. ISBN 9780199549351.
  28. ^ Воутерс, Берт; Брюггинк, Сис; Десмет, Герт; Агроскин Юрий; Пол, Кристофер А.; Илтинк, Себастьян (21 августа 2012 г.). «Капиллярная ионная хроматография при высоком давлении и температуре». Аналитическая химия . 84 (16): 7212–7217. дои : 10.1021/ac301598j. ПМИД  22830640.
  29. ^ Эскудер-Гилаберт, Л.; Бермудес-Салданья, Х.М.; Вильянуэва-Каманьяс, РМ; Медина-Эрнандес, MJ; Саградо, С. (16 апреля 2004 г.). «Надежность оценок коэффициента удерживания в жидкостной хроматографии». Журнал хроматографии А. 1033 (2): 247–255. doi :10.1016/j.chroma.2004.01.038. ПМИД  15088745.
  30. ^ Сибукава, Масами; Симасаки, Томоми; Сайто, Синго; Ярита, Такаши (1 октября 2009 г.). «Ионообменная хроматография перегретой воды: экспериментальный подход к интерпретации селективности разделения в ионообменных процессах». Аналитическая химия . 81 (19): 8025–8032. дои : 10.1021/ac9011864. ПМИД  19743878.
  31. ^ Эпплинг, Дин; Энтони-Кэхилл, Спенсер; Мэтьюз, Кристофер (2016). Биохимия: понятия и связи . Нью-Джерси: Пирсон. п. 134. ИСБН 9780321839923.
  32. ^ Альперт, Эндрю Дж.; Худеч, Отто; Мехтлер, Карл (5 мая 2015 г.). «Анионообменная хроматография фосфопептидов: слабый анионообменный обмен по сравнению с сильным анионообменным обменом и анионообменная хроматография по сравнению с хроматографией электростатического отталкивания и гидрофильного взаимодействия». Аналитическая химия . 87 (9): 4704–4711. дои : 10.1021/ac504420c. ПМЦ 4423237 . ПМИД  25827581. 
  33. ^ Драган, ES; Аврам, Э.; Дину, М.В. (1 июля 2006 г.). «Органические ионообменники в виде шариков. Синтез, характеристика и применение». Полимеры для передовых технологий . 17 (7–8): 571–578. дои : 10.1002/пат.755.
  34. ^ Швелленбах Дж., Тафт Ф., Злодей Л. и Штрубе Дж. (2016). Получение и определение характеристик высокоемких адсорбентов на основе сильных катионообменных волокон. Журнал хроматографии А, 1447, 92–106.
  35. ^ Холлабо, CB; Берт, Лиланд Х.; Уолш, Анна Петерсон (октябрь 1945 г.). «Карбоксиметилцеллюлоза... Использование и применение». Промышленная и инженерная химия . 37 (10): 943–947. дои : 10.1021/ie50430a015.
  36. ^ Харрис, Дэниел К. (2010). Количественный химический анализ . Нью-Йорк: WH Freeman and Company. п. 637. ИСБН 978-1429218153.
  37. ^ Харрис, Дэниел К. (2010). Количественный химический анализ . Нью-Йорк: WH Freeman and Company. п. 638. ИСБН 978-1429218153.
  38. ^ Кумар, Панав (2018). Основы и методы биофизики и молекулярной биологии . Нью-Дели: Публикация Pathfinder. п. 7. ISBN 978-93-80473-15-4.
  39. ^ Кнудсен, Х.Л., Фарнер, Р.Л., Сюй, Ю., Норлинг, Л.А., и Бланк, Г.С. (2001). Мембранная ионообменная хроматография для очистки антител в масштабе процесса. Журнал хроматографии А, 907(1), 145-154.
  40. ^ Шаркоссет, К. (1998). Очистка белков методом мембранной хроматографии. Журнал химической технологии и биотехнологии, 71 (2), 95–110.
  41. ^ Бой, К. (2007). Мембранные адсорберы как средства очистки моноклональных антител. Журнал хроматографии Б, 848 (1), 19-27.
  42. ^ Томмес Дж. и Кула М.Р. (1995). Мембранная хроматография — интегративная концепция последующей обработки белков. Прогресс биотехнологии, 11 (4), 357-367.
  43. ^ Брандт, С (1988). «Мембранная аффинная технология для очистки в промышленных масштабах». Био/Технологии . 6 (7): 779–782. дои : 10.1038/nbt0788-779. S2CID  26477901.
  44. ^ Ян, Хивон; Виера, Кларивель; Фишер, Иоахим; Этцель, Марк Р. (2002). «Очистка крупного белка с помощью ионообменных мембран». Исследования в области промышленной и инженерной химии . 41 (6): 1597–1602. дои : 10.1021/ie010585l.
  45. ^ Ропер, Д. Кейт; Лайтфут, Эдвин Н. (1995). «Разделение биомолекул с помощью адсорбционных мембран». Журнал хроматографии А. 702 (1–2): 3–26. дои : 10.1016/0021-9673(95)00010-К.
  46. ^ Какулитан, Нинья Г.; Кай, Хироюки; Лю, Юланка Ю.; Фэй, Николь; Ю, Ян; Ломюллер, Теобальд; О'Донохью, Джефф П.; Гроувс, Джей Т. (2014). «Размерная хроматография сигнальных кластеров в мембране живой клетки». Нано-буквы . 14 (5): 2293–2298. Бибкод : 2014NanoL..14.2293C. дои : 10.1021/nl404514e. ПМК 4025576 . ПМИД  24655064. 
  47. ^ Свец, Франтишек.; Фреше, Жан MJ (1992). «Непрерывные стержни из макропористого полимера как высокоэффективная разделительная среда для жидкостной хроматографии». Аналитическая химия . 64 (7): 820–822. дои : 10.1021/ac00031a022.
  48. ^ Гарретт, Реджинальд Х.; Гришэм, Чарльз М. (2009). Биохимия (4-е изд.). Пасифик Гроув, Калифорния: Брукс/Коул. стр. 71–75. ISBN 978-0-495-11464-2 . 
  49. ^ Дасгупта, Пурненду К. (1992). «Ионная хроматография: современное состояние». Аналитическая химия . 64 (15): 775А–783А. дои : 10.1021/ac00039a722.
  50. ^ Сакаш, Дж.Б.; Кантровитц, ER (2000). «Вклад отдельных межцепных взаимодействий в стабилизацию состояний T и R аспартат-транскарбамоилазы Escherichia coli». J Биол Хим . 275 (37): 28701–7. дои : 10.1074/jbc.M005079200 . ПМИД  10875936.
  51. ^ Фэрхед, М. (2013). «Сопряжение по принципу «включи и работай» с помощью определенных двухвалентных стрептавидинов». Дж Мол Биол . 426 (1): 199–214. дои : 10.1016/j.jmb.2013.09.016. ПМК 4047826 . ПМИД  24056174. 
  52. ^ Хефтманн, Эрих (2004). Хроматография. Основы и приложения хроматографии и родственных методов дифференциальной миграции: Приложения . Амстердам: Эльзевир. п. 716. ИСБН 9780080472256.
  53. ^ Грегор, Гарри П. (1951). «Равновесие Гиббса-Доннана в системах ионообменных смол». Журнал Американского химического общества . 73 (2): 642–650. дои : 10.1021/ja01146a042.
  54. ^ аб Риман, Уильям, Гарольд Ф. Уолтон, Р. Белчер и Х. Фрейзер (2013). Ионный обмен в аналитической химии Международная серия монографий по аналитической химии . Берлингтон: Elsevier Science.
  55. ^ Хаузер, Питер К. (2016). «Определение ионов щелочи в биологических и экологических пробах». В Астрид Сигел; Хельмут, Сигель; Роланд КО, Сигел (ред.). Ионы щелочных металлов: их роль для жизни . Ионы металлов в науках о жизни. Том. 16. Спрингер. стр. 11–25. дои : 10.1007/978-3-319-21756-7_2. ISBN 978-3-319-21755-0. ПМИД  26860298.
  56. ^ Лукман, Мохаммад и Инамуддин (2012). Технология ионного обмена II . Спрингер Нидерланды. п. 169. ISBN 978-94-007-4026-6 . 
  57. ^ ab Роберт Э. Смит (31 декабря 1987 г.). Применение ионной хроматографии. ЦРК Пресс. ISBN 978-0-8493-4967-6.
  58. ^ Бхаттачарья, Локеш; Рорер, Джеффри (2012). Применение ионной хроматографии в анализе фармацевтических и биологических продуктов . Уайли. п. 247. ИСБН 978-0470467091.
  59. ^ Ханко, Валоран П.; Рорер, Джеффри С. (2012). «Ионно-хроматографический анализ аминогликозидных антибиотиков». Применение ионной хроматографии для фармацевтических и биологических продуктов . п. 175. дои : 10.1002/9781118147009.ch8. ISBN 9781118147009.
  60. ^ Дженке, Д. (2011). «Применение ионной хроматографии в фармацевтическом анализе и анализе лекарств». Журнал хроматографической науки . 49 (7): 524–39. дои : 10.1093/chrsci/49.7.524 . ПМИД  21801484.

Библиография

Внешние ссылки