Репликация по принципу катящегося кольца ( RCR ) — это процесс однонаправленной репликации нуклеиновых кислот , который может быстро синтезировать множественные копии кольцевых молекул ДНК или РНК , таких как плазмиды , геномы бактериофагов и кольцевой РНК- геном вироидов . Некоторые эукариотические вирусы также реплицируют свою ДНК или РНК с помощью механизма катящегося кольца.
Как упрощенная версия естественной репликации по принципу катящегося кольца , была разработана изотермическая техника амплификации ДНК , амплификация по принципу катящегося кольца. Механизм RCA широко используется в молекулярной биологии и биомедицинской нанотехнологии , особенно в области биосенсорики (как метод усиления сигнала). [1]
Репликация ДНК по типу катящегося кольца инициируется белком-инициатором, кодируемым плазмидой или ДНК бактериофага, который разрезает одну цепь двухцепочечной кольцевой молекулы ДНК в месте, называемом точкой начала двухцепочечной ДНК, или DSO. Белок-инициатор остается связанным с 5'-фосфатным концом разорванной цепи, а свободный 3'-гидроксильный конец высвобождается, чтобы служить праймером для синтеза ДНК ДНК-полимеразой III . Используя неразрезанную цепь в качестве матрицы, репликация продолжается вокруг кольцевой молекулы ДНК, вытесняя разорванную цепь как одноцепочечную ДНК. Вытеснение разорванной цепи осуществляется кодируемой хозяином геликазой, называемой PcrA (аббревиатура означает plasmid copy Reduced), в присутствии белка инициации репликации плазмиды.
Продолжение синтеза ДНК может производить несколько одноцепочечных линейных копий исходной ДНК в непрерывной серии «голова к хвосту», называемой конкатемером . Эти линейные копии могут быть преобразованы в двухцепочечные кольцевые молекулы посредством следующего процесса:
Сначала белок-инициатор делает еще один надрез в ДНК, чтобы завершить синтез первой (ведущей) цепи. Затем РНК-полимераза и ДНК-полимераза III реплицируют одноцепочечный источник ДНК (SSO), чтобы создать еще одно двухцепочечное кольцо. ДНК-полимераза I удаляет праймер, заменяя его ДНК, а ДНК-лигаза соединяет концы, чтобы создать еще одну молекулу двухцепочечной кольцевой ДНК.
Подводя итог, можно сказать, что типичная репликация ДНК по принципу катящегося кольца состоит из пяти этапов: [2]
Некоторые ДНК-вирусы реплицируют свою геномную информацию в клетках-хозяевах посредством репликации по принципу катящегося кольца. Например, вирус герпеса человека-6 (HHV-6) (hibv) экспрессирует набор «ранних генов», которые, как полагают, участвуют в этом процессе. [3] Длинные конкатемеры , которые получаются в результате, впоследствии расщепляются между областями pac-1 и pac-2 генома HHV-6 рибозимами, когда он упаковывается в отдельные вирионы. [4]
Вирус папилломы человека-16 (ВПЧ-16) — еще один вирус, который использует циклическую репликацию для производства потомства с высокой скоростью. ВПЧ-16 заражает эпителиальные клетки человека и имеет двухцепочечный кольцевой геном. Во время репликации, в начале, гексамер E1 оборачивается вокруг одноцепочечной ДНК и движется в направлении от 3' до 5'. При нормальной двунаправленной репликации два репликационных белка будут диссоциировать во время столкновения, но в ВПЧ-16 считается, что гексамер E1 не диссоциирует, что приводит к непрерывной циклической репликации. Считается, что этот механизм репликации ВПЧ может иметь физиологические последствия для интеграции вируса в хромосому хозяина и возможного прогрессирования в рак шейки матки. [5]
Кроме того, геминивирус также использует репликацию по принципу катящегося кольца в качестве механизма репликации. Это вирус, который отвечает за уничтожение многих основных культур, таких как маниока, хлопок, бобовые, кукуруза, томаты и бамия. Вирус имеет кольцевую одноцепочечную ДНК, которая реплицируется в клетках растения-хозяина. Весь процесс инициируется белком-инициатором репликации геминивируса, Rep, который также отвечает за изменение среды хозяина, чтобы действовать как часть механизма репликации. Rep также поразительно похож на большинство других белков-инициаторов катящейся репликации эубактерий, с наличием мотивов I, II и III на его N-конце. Во время репликации по принципу катящегося кольца одноцепочечная ДНК геминивируса преобразуется в двуцепочечную ДНК, а затем Rep присоединяется к двуцепочечной ДНК в исходной последовательности TAATATTAC. После того, как Rep, вместе с другими репликационными белками, связывается с dsDNA, он образует петлю стебля, где ДНК затем расщепляется в последовательности наномера, вызывая смещение цепи. Это смещение позволяет репликационной вилке продвигаться в направлении от 3' к 5', что в конечном итоге дает новую цепь ssDNA и конкатамерную цепь ДНК. [6]
Промежуточные продукты репликации ДНК бактериофага Т4 включают кольцевые и разветвленные кольцевые конкатемерные структуры. [7] Эти структуры, вероятно, отражают механизм репликации по принципу катящегося кольца.
Некоторые РНК-вирусы и вироиды также реплицируют свой геном посредством репликации РНК по принципу катящегося кольца. Для вироидов существуют два альтернативных пути репликации РНК, которым следуют члены семейства Pospiviroidae (асимметричная репликация) и Avsunviroidae (симметричная репликация).
В семействе Pospiviroidae (подобных PSTVd) кольцевая плюс-цепь РНК транскрибируется РНК-полимеразой хозяина в олигомерные минус-цепи, а затем в олигомерные плюс-цепи. [8] Эти олигомерные плюс-цепи расщепляются РНК-азой хозяина и лигируются РНК-лигазой хозяина для реформирования мономерной плюс-цепи кольцевой РНК. Это называется асимметричным путем репликации по типу катящегося кольца. Вироиды семейства Avsunviroidae (подобных ASBVd) реплицируют свой геном через симметричный путь репликации по типу катящегося кольца. [9] В этом симметричном пути олигомерные минус-цепи сначала расщепляются и лигируются для формирования мономерных минус-цепей, а затем транскрибируются в олигомерные плюс-цепи. Эти олигомерные плюс-цепи затем расщепляются и лигируются для реформирования мономерной плюс-цепи. Симметричный путь репликации получил такое название потому, что и плюс-, и минус-цепи образуются одинаково.
Расщепление олигомерных плюс- и минус-цепей опосредовано саморасщепляющейся структурой рибозима в виде головки молотка , присутствующей у Avsunviroidae, но такая структура отсутствует у Pospiviroidae. [10]
Производная форма репликации по принципу катящегося кольца успешно использовалась для амплификации ДНК из очень малых количеств исходного материала. [1] Этот метод амплификации называется амплификация по принципу катящегося кольца (RCA). В отличие от обычных методов амплификации ДНК, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР) , RCA представляет собой изотермический метод амплификации нуклеиновых кислот , при котором полимераза непрерывно добавляет отдельные нуклеотиды к праймеру, отожженному на кольцевой матрице, что приводит к образованию длинного конкатемера одноцепочечной ДНК, содержащего от десятков до сотен тандемных повторов (комплементарных кольцевой матрице). [11]
Для проведения реакции RCA необходимы пять важных компонентов:
Полимеразы, используемые в RCA, — это ДНК-полимераза Phi29 , Bst и Vent exo- для амплификации ДНК и РНК-полимераза T7 для амплификации РНК. Поскольку ДНК-полимераза Phi29 обладает лучшей процессивностью и способностью к смещению цепи среди всех вышеупомянутых полимераз, она чаще всего используется в реакциях RCA. В отличие от полимеразной цепной реакции (ПЦР), RCA можно проводить при постоянной температуре (от комнатной температуры до 65 °C) как в свободном растворе, так и поверх иммобилизованных мишеней (твердофазная амплификация).
Реакция ДНК-RCA обычно состоит из трех этапов:
RCA производит линейную амплификацию ДНК, поскольку каждая круговая матрица растет с заданной скоростью в течение определенного периода времени. Для увеличения выхода и достижения экспоненциальной амплификации, как это делает ПЦР, было исследовано несколько подходов. Одним из них является гиперразветвленная амплификация катящегося кольца или HRCA, где праймеры, которые отжигаются с исходными продуктами RCA, добавляются, а также удлиняются. [12] Таким образом, исходная RCA создает больше матрицы, которая может быть амплифицирована. Другой - амплификация круг-к-кругу или C2CA, где продукты RCA расщепляются рестриктазой и лигируются в новые круговые матрицы с использованием рестриктазы, за которой следует новый раунд RCA с большим количеством круговых матриц для амплификации. [13]
RCA может усиливать единичное молекулярное связывающее событие более чем в тысячу раз, что делает его особенно полезным для обнаружения целей с ультранизким содержанием. Реакции RCA можно проводить не только в свободных растворных средах, но и на твердой поверхности, такой как стекло, микро- или нано-бусины, микропланшеты, микрофлюидные устройства или даже бумажные полоски. Эта особенность делает его очень мощным инструментом для усиления сигналов в твердофазных иммуноанализах (например, ELISA ). Таким образом, RCA становится весьма универсальным инструментом усиления сигнала с широким спектром применения в геномике, протеомике, диагностике и биосенсорике.
Иммуно-RCA — это метод изотермического усиления сигнала для высокоспецифичного и высокочувствительного обнаружения и количественного определения белков. Этот метод объединяет две области: RCA, который позволяет проводить нуклеотидную амплификацию, и иммуноанализ, который использует антитела, специфичные для внутриклеточных или свободных биомаркеров. В результате иммуно-RCA дает специфический усиленный сигнал (высокое отношение сигнал/шум), что делает его пригодным для обнаружения, количественного определения и визуализации малораспространенных белковых маркеров в жидкофазных иммуноанализах [14] [15] [16] и иммуногистохимии .
Иммуно-RCA следует типичной иммуноадсорбционной реакции в ИФА или иммуногистохимическом окрашивании тканей. [17] Детектирующие антитела, используемые в реакции иммуно-RCA, модифицируются путем присоединения олигонуклеотида ssDNA к концу тяжелых цепей. Таким образом, Fab (фрагмент, связывание антигена) участок на детектирующем антителе все еще может связываться со специфическими антигенами, а олигонуклеотид может служить праймером реакции RCA.
Типичная процедура иммуно-RCA с использованием антител выглядит следующим образом:
1. Детекторное антитело распознает специфическую белковую мишень. Это антитело также прикреплено к олигонуклеотидному праймеру.
2. При наличии кольцевой ДНК она отжигается, и праймер сопоставляется с комплементарной последовательностью кольцевой ДНК.
3. Комплементарная последовательность кольцевой ДНК-матрицы копируется сотни раз и остается прикрепленной к антителу.
4. Выход RCA (удлиненная одноцепочечная ДНК) обнаруживается с помощью флуоресцентных зондов с использованием флуоресцентного микроскопа или микропланшетного ридера.
В дополнение к иммуно-RCA, опосредованной антителами, праймер ssDNA RCA также может быть конъюгирован с 3'-концом ДНК-аптамера. Хвост праймера может быть амплифицирован посредством амплификации по типу катящегося кольца. Продукт может быть визуализирован посредством маркировки флуоресцентного репортера. [19] Процесс проиллюстрирован на рисунке справа.
Различные производные RCA широко использовались в области биосенсорики. Например, RCA успешно использовался для обнаружения наличия вирусной и бактериальной ДНК в клинических образцах, [20] [21], что очень полезно для быстрой диагностики инфекционных заболеваний . Он также использовался в качестве метода усиления сигнала на чипе для анализа микроматриц нуклеиновых кислот (как для ДНК, так и для РНК) . [1]
В дополнение к функции усиления в биосенсорных приложениях, метод RCA может быть применен для создания ДНК-наноструктур и ДНК- гидрогелей . Продукты RCA также могут быть использованы в качестве шаблонов для периодической сборки нановидов или белков, синтеза металлических нанопроводов [22] и формирования наноостровов. [1]