stringtranslate.com

НЕК 293 ячейки

Клетки эмбриональной почки человека 293 , также часто называемые клетками HEK 293 , HEK-293 , 293 , представляют собой иммортализованную клеточную линию , полученную из клеток HEK, выделенных из плода женского пола в 1970-х годах. [1] [2]

Клеточная линия HEK 293 широко использовалась в исследованиях на протяжении десятилетий благодаря ее надежному и быстрому росту и склонности к трансфекции . Эта клеточная линия используется в биотехнологической промышленности для производства терапевтических белков и вирусов для генной терапии , а также для тестирования безопасности широкого спектра химических веществ.

История

Клетки HEK 293 были получены в 1973 году путем трансфекции культур нормальных клеток эмбриональных почек человека с расщепленной ДНК аденовируса 5 в лаборатории Алекса ван дер Эба в Лейдене, Нидерланды . Клетки были получены от одного абортированного или выкидышного плода, точное происхождение которого неясно. [3] [2] Клетки культивировали Ван дер Эб; трансдукцию аденовирусом выполнил Фрэнк Грэм , постдокторант лаборатории ван дер Эба. Они были опубликованы в 1977 году после того, как Грэм уехал из Лейдена в Университет Макмастера . [4] Их называют HEK, поскольку они произошли из культур эмбриональных почек человека, а число 293 произошло из-за привычки Грэма нумеровать свои эксперименты; оригинальный клон клеток HEK 293 был получен из его 293-го эксперимента. Грэм выполнил трансфекцию в общей сложности восемь раз, получив всего один клон клеток, который культивировали в течение нескольких месяцев. Предположительно адаптировавшись к тканевой культуре, клетки этого клона развились в относительно стабильную линию HEK 293.

Последующий анализ показал, что трансформация была вызвана вставкой ~4,5 тысяч оснований из левого плеча аденовирусного генома, который стал включенным в хромосому человека 19 . [5]

В течение многих лет предполагалось, что клетки HEK 293 образуются в результате трансформации фибробластических , эндотелиальных или эпителиальных клеток , которые в изобилии присутствуют в почках. Однако первоначальная трансформация аденовируса оказалась неэффективной, что позволяет предположить, что клетка, которая в конечном итоге продуцировала линию HEK 293, могла быть в некотором роде необычной. Грэм и его коллеги предоставили доказательства того, что клетки HEK 293 и другие клеточные линии человека, полученные в результате аденовирусной трансформации клеток эмбриональных почек человека, обладают многими свойствами незрелых нейронов , что позволяет предположить, что аденовирус преимущественно трансформировал клетки нейрональной линии в исходной культуре почек. [6]

Всестороннее исследование геномов и транскриптомов HEK 293 и пяти производных клеточных линий сравнило транскриптом HEK 293 с транскриптомом почек, надпочечников, гипофиза и центральной нервной ткани человека. [7] Структура HEK 293 больше всего напоминала структуру клеток надпочечников, которые обладают множеством нейрональных свойств. Учитывая расположение надпочечника ( « надпочечник» означает «рядом с почкой»), несколько клеток надпочечников вполне могли появиться в культуре, полученной из эмбриональной почки, и могли быть преимущественно трансформированы аденовирусом. Аденовирусы трансформируют клетки нейронального происхождения гораздо эффективнее, чем типичные эпителиальные клетки почек человека. [6] Таким образом, эмбриональная клетка-предшественник надпочечников кажется наиболее вероятной исходной клеткой линии HEK 293. Как следствие, клетки HEK 293 не следует использовать в качестве модели типичных клеток почек in vitro .

Клетки HEK 293 имеют сложный кариотип , имеющий две или более копии каждой хромосомы и модальное число хромосом 64. Они описываются как гипотриплоидные, содержащие менее чем в три раза больше хромосом, чем гаплоидная человеческая гамета. Хромосомные аномалии включают в общей сложности три копии Х -хромосом и четыре копии хромосомы 17 и хромосомы 22 . [7] [8] Наличие нескольких Х-хромосом и отсутствие каких-либо следов последовательности, полученной из Y-хромосомы , позволяют предположить, что исходный плод был женского пола.

Линия клеток 293T была создана в лаборатории Мишеля Калоса в Стэнфорде путем стабильной трансфекции линии клеток HEK 293 плазмидой, кодирующей термочувствительный мутант большого T-антигена SV40; Первоначально он назывался 293/ tsA1609neo . [9] Первым упоминанием клеточной линии как «293T» может быть ее использование для создания линии пакующих клеток BOSC23 для производства ретровирусных частиц. [10]

Варианты

Сообщалось о нескольких вариантах HEK 293. [11] [12]

ХЕК 293Т

Трансфекция, использованная для создания 293T (с использованием плазмиды pRSV-1609), обеспечивала устойчивость к неомицину / G418 и экспрессию аллели tsA1609 большого T-антигена SV40; этот аллель полностью активен при 33 °C (его допустимая температура ), выполняет значительную функцию при 37 °C и неактивен при 40 °C. [14] 293T очень эффективно трансфицируется ДНК (как и его родительский HEK 293). Из-за экспрессии большого Т-антигена SV40 трансфицированные плазмидные ДНК, несущие точку начала репликации SV40 , могут реплицироваться в 293T и временно сохранять большое количество копий; это может значительно увеличить количество рекомбинантного белка или ретровируса, которое может быть получено из клеток.

Были определены полные последовательности генома трех различных изолятов 293Т. Они очень похожи друг на друга, но обнаруживают заметные отличия от родительской клеточной линии HEK 293. [15]

HEK293-ENT1KO

Этот мутантный штамм не экспрессирует равновесный переносчик нуклеозидов ENT1. Ген был нокаутирован с помощью CRISPR-CAS9 , и линия клеток сохранила экспрессию ENT2. [16]

Приложения

Иммунофлуоресцентные клетки HEK 293

Клетки HEK 293 легко выращивать в культуре и трансфицировать. Их использовали в качестве хозяев для экспрессии генов . Обычно эти эксперименты включают трансфекцию интересующего гена (или комбинации генов) и последующий анализ экспрессированного белка . Широкое использование этой клеточной линии обусловлено ее трансфекцией различными методами, в том числе методом фосфата кальция , с достижением эффективности, приближающейся к 100%.

Примеры таких экспериментов включают в себя:

В 1985 году клетки HEK 293 были адаптированы для роста в суспензионной культуре, а не для пролиферации на пластиковых чашках. [22] Это позволило выращивать большие количества рекомбинантных аденовирусных векторов.

Более специфическое использование клеток HEK 293 заключается в размножении аденовирусных векторов . [23] Вирусы предлагают эффективные средства доставки генов в клетки, для чего они и эволюционировали, и поэтому широко используются в качестве экспериментальных инструментов. Однако, будучи патогенами , они также представляют опасность для экспериментатора. Этой опасности можно избежать, используя вирусы, у которых отсутствуют ключевые гены и которые, следовательно, не способны размножаться после проникновения в клетку. Для размножения таких вирусных векторов необходима линия клеток, экспрессирующая недостающие гены. Поскольку клетки HEK 293 экспрессируют ряд аденовирусных генов, их можно использовать для размножения аденовирусных векторов, в которых эти гены (обычно E1 и E3) удалены, например AdEasy. [24] Однако гомологичная рекомбинация между вставленной клеточной последовательностью Ad5 и последовательностью вектора, хотя и редкая, может восстановить репликационную способность вектора. [25]

Важным вариантом этой клеточной линии является клеточная линия 293Т . Он содержит большой Т-антиген SV40 , который обеспечивает эписомальную репликацию трансфицированных плазмид, содержащих точку начала репликации SV40. Это позволяет амплифицировать трансфицированные плазмиды и продлить временную экспрессию желаемых генных продуктов. Клетки HEK 293 и особенно HEK 293T обычно используются для производства различных ретровирусных векторов. [26] На основе этих клеток также созданы различные линии ретровирусных упаковочных клеток.

Представляющие интерес нативные белки

В зависимости от различных условий экспрессия гена клеток HEK 293 может меняться. Следующие представляющие интерес белки (среди многих других) обычно обнаруживаются в необработанных клетках HEK 293:

Биоэтика

Элвин Вонг, католический специалист по биоэтике, утверждает, что, несмотря на неопределенность относительно происхождения эмбриональных клеток, использованных для получения клеточной линии, можно сделать вывод, что она произошла в результате добровольного аборта . Для некоторых это может представлять этическую дилемму при использовании HEK 293 и производных продуктов, таких как вакцины и многие лекарства. [31] [32] [33] [34]

21 декабря 2020 года Римско-католическая Конгрегация доктрины веры заявила, что моральный долг избегать вакцин, изготовленных из клеточных линий, полученных из эмбрионов, «не является обязательным, если существует серьезная опасность, такая как неконтролируемое в противном случае распространение серьезной инфекции». патологическое событие — в данном случае пандемическое распространение вируса SARS-CoV-2, вызывающего Covid-19». Затем заявление оправдывает использование других вакцин: «все прививки, признанные клинически безопасными и эффективными, могут быть использованы с чистой совестью...» [35]

Во время пандемии COVID-19 активисты против вакцинации отметили, что клетки HEK 293 используются при производстве вакцины Oxford-AstraZeneca против COVID-19 (AKA AZD1222). Клетки отфильтровываются из конечных продуктов. [36]

Компания Regeneron Pharmaceuticals , производитель REGN-COV2, терапевтического коктейля антител, используемого для облегчения симптомов пациентов с COVID-19, не использовала клетки HEK 293T для производства коктейля антител, но использовала эти клетки для оценки эффективности препарата. [37] [32]

В ответ на этические проблемы производства вакцин было предложено несколько стратегий, которые врачи могли бы обсудить со своими пациентами. [38]


Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Кавсан, Вадим М; Ершов Антон В.; Балинская, Елена В. (23 мая 2011 г.). «Иммортализованные клетки и один онкоген в злокачественной трансформации: старые идеи о новом объяснении». Клеточная биология BMC . 12:23 . дои : 10.1186/1471-2121-12-23 . ПМЦ  3224126 . ПМИД  21605454.
  2. ↑ ab Austriaco N (25 мая 2020 г.). «Моральное руководство по использованию вакцин против COVID-19, разработанных на основе линий фетальных клеток человека». Публичный дискурс . Институт Уизерспун . Проверено 23 декабря 2020 г. Несколько месяцев назад я получил электронное письмо от профессора Фрэнка Грэма, создателя этой клеточной линии. Он говорит мне, что, насколько ему известно, точное происхождение фетальных клеток HEK293 неясно. Они могли возникнуть либо в результате самопроизвольного выкидыша, либо в результате планового аборта.
  3. ^ ван дер Эб А. «CTR FDA США для оценки и исследования биологических препаратов, вакцин и сопутствующих биологических продуктов, заседание Консультативного комитета» (PDF) . Строки 14–22: USFDA. п. 81. Архивировано из оригинала (PDF) 16 мая 2017 г. Проверено 11 августа 2012 г.{{cite web}}: CS1 maint: местоположение ( ссылка )
  4. ^ Грэм Флорида, Смайли Дж., Рассел У.К., Нэрн Р. (июль 1977 г.). «Характеристики линии клеток человека, трансформированной ДНК аденовируса человека типа 5». Журнал общей вирусологии . 36 (1): 59–74. CiteSeerX 10.1.1.486.3027 . дои : 10.1099/0022-1317-36-1-59. ПМИД  886304. 
  5. ^ Луи Н., Эвел С., Грэм Флорида (июль 1997 г.). «Клонирование и секвенирование клеточно-вирусных соединений из линии клеток 293, трансформированной аденовирусом человека типа 5». Вирусология . 233 (2): 423–9. дои : 10.1006/виро.1997.8597 . ПМИД  9217065.
  6. ^ аб Шоу Дж., Морс С., Арарат М., Грэм Флорида (июнь 2002 г.). «Преимущественная трансформация нейрональных клеток человека аденовирусами человека и происхождение клеток HEK 293». Журнал ФАСЭБ . 16 (8): 869–71. doi : 10.1096/fj.01-0995fje . PMID  11967234. S2CID  6519203.
  7. ^ ab Лин Ю.К., Бун М., Меурис Л., Лемменс И., Ван Рой Н., Соете А. и др. (сентябрь 2014 г.). «Динамика генома линии эмбриональных почек человека 293 в ответ на манипуляции клеточной биологии». Природные коммуникации . 5 (8): 4767. Бибкод : 2014NatCo...5.4767L. doi : 10.1038/ncomms5767. ПМК 4166678 . ПМИД  25182477. 
  8. ^ «Запись в каталоге ECACC для HEK 293» . hpaculturals.org.uk . ЕСАКК . Архивировано из оригинала 2 мая 2012 г. Проверено 18 марта 2012 г.
  9. ^ Дубридж РБ, Тан П., Ся ХК, Леонг ПМ, Миллер Дж. Х., Калос MP (январь 1987 г.). «Анализ мутаций в клетках человека с использованием челночной системы вируса Эпштейна-Барра». Мол. Клетка. Биол . 7 (1): 379–387. дои : 10.1128/MCB.7.1.379. ПМК 365079 . ПМИД  3031469. 
  10. ^ Груша WS, Нолан ГП, Скотт МЛ, Балтимор Д (15 сентября 1993 г.). «Производство бесхелперных ретровирусов с высоким титром путем временной трансфекции». Учеб. Натл. акад. наук. США . 90 (18): 8392–8396. Бибкод : 1993PNAS...90.8392P. дои : 10.1073/pnas.90.18.8392 . ПМК 47362 . ПМИД  7690960. 
  11. ^ Абаанду, Лаура; Куан, Дэвид; Шилоах, Джозеф (2 июля 2021 г.). «Влияние на рост и продуктивность клеток HEK293 путем изменения экспрессии специфических генов». Клетки . 10 (7): 1667. doi : 10.3390/cells10071667 . ISSN  2073-4409. ПМЦ 8304725 . ПМИД  34359846. 
  12. ^ Шахид, Найяр; Хромвель, Кристофер; Хаббард, Бэзил; Хаммонд, Джеймс (май 2021 г.). «Характеристика новой клеточной линии HEK293 (HEK293-ENT1KO) для оценки роли равновесного переносчика нуклеозидов подтипа 2». Журнал ФАСЭБ . 35 (С1). дои : 10.1096/fasebj.2021.35.S1.02185 . ISSN  0892-6638.
  13. ^ «Платформа экспрессии HEK293 (L-10894/11266/11565)» (PDF) . Национальный исследовательский совет Канады. Апрель 2019.
  14. ^ Рио, округ Колумбия, Кларк С.Г., Тжиан Р. (4 января 1985 г.). «Система-вектор-хозяин млекопитающих, которая регулирует экспрессию и амплификацию трансфицированных генов путем температурной индукции». Наука . 227 (4682): 23–28. Бибкод : 1985Sci...227...23R. дои : 10.1126/science.2981116. ПМИД  2981116.
  15. ^ Лин Ю.К., Бун М., Мейрис Л., Лемменс И., Ван Рой Н., Соете А., Реймерс Дж., Мойсс М., Плезанс С., Дрманак Р., Чен Дж., Спелеман Ф., Ламбрехтс Д., Ван де Пер Ю., Тавернье Дж., Каллеварт. Н (3 сентября 2014 г.). «Динамика генома линии эмбриональных почек человека 293 в ответ на манипуляции клеточной биологии». Нат. Коммун . 5 . 4767. Бибкод : 2014NatCo...5.4767L. doi : 10.1038/ncomms5767. ПМК 4166678 . ПМИД  25182477. 
  16. ^ Шахид, Найяр; Хромвель, Кристофер; Хаббард, Бэзил; Хаммонд, Джеймс (май 2021 г.). «Характеристика новой клеточной линии HEK293 (HEK293-ENT1KO) для оценки роли равновесного переносчика нуклеозидов подтипа 2». Журнал ФАСЭБ . 35 (С1). дои : 10.1096/fasebj.2021.35.S1.02185 . ISSN  0892-6638.
  17. ^ Фредж С., Сэмпсон К.Дж., Лю Х., Касс Р.С. (май 2006 г.). «Молекулярная основа ранолазиновой блокады мутантных натриевых каналов LQT-3: данные о месте действия». Британский журнал фармакологии . 148 (1): 16–24. дои : 10.1038/sj.bjp.0706709. ПМК 1617037 . ПМИД  16520744. 
  18. ^ Амар Л., Дескло М., Фокон-Биге Н., Малле Дж., Фогель Р. (март 2006 г.). «Контроль малых ингибирующих уровней РНК и интерференции РНК путем индуцированной доксициклином активации минимального промотора РНК-полимеразы III». Исследования нуклеиновых кислот . 34 (5): е37. дои : 10.1093/nar/gkl034. ПМК 1390691 . ПМИД  16522642. 
  19. ^ Канно Т., Ямамото Х., Ягучи Т., Хи Р., Мукаса Т., Фудзикава Х. и др. (июнь 2006 г.). «Производное линолевой кислоты DCP-LA избирательно активирует PKC-эпсилон, возможно, связываясь с сайтом связывания фосфатидилсерина». Журнал исследований липидов . 47 (6): 1146–56. doi : 10.1194/jlr.M500329-JLR200 . ПМИД  16520488.
  20. ^ Ли Т, Паудель Х.К. (март 2006 г.). «Киназа гликогенсинтазы 3бета фосфорилирует специфичный для болезни Альцгеймера Ser396 тау-белка, связанного с микротрубочками, по последовательному механизму». Биохимия . 45 (10): 3125–33. дои : 10.1021/bi051634r. ПМИД  16519507.
  21. ^ Мустафа Х., Штрассер Б., Раут С., Ирвинг Р.А., Варк К.Л. (апрель 2006 г.). «Идентификация функционального сигнала ядерного экспорта в зеленом флуоресцентном белке asFP499». Связь с биохимическими и биофизическими исследованиями . 342 (4): 1178–82. дои : 10.1016/j.bbrc.2006.02.077. ПМИД  16516151.
  22. ^ Стиллман Б.В., Глузман Ю. (август 1985 г.). «Репликация и суперспирализация ДНК обезьяньего вируса 40 в клеточных экстрактах клеток человека». Молекулярная и клеточная биология . 5 (8): 2051–60. дои : 10.1128/mcb.5.8.2051 . ПМК 366923 . ПМИД  3018548. 
  23. ^ Томас П., Smart TG (2005). «Клеточная линия HEK293: средство экспрессии рекомбинантных белков». Журнал фармакологических и токсикологических методов . 51 (3): 187–200. doi :10.1016/j.vascn.2004.08.014. ПМИД  15862464.
  24. ^ Хэ TC, Чжоу С, да Коста LT, Ю Дж, Кинцлер К.В., Фогельштейн Б (март 1998 г.). «Упрощенная система создания рекомбинантных аденовирусов». Proc Natl Acad Sci США . 95 (5): 2509–14. Бибкод : 1998PNAS...95.2509H. дои : 10.1073/pnas.95.5.2509 . ЧВК 19394 . ПМИД  9482916. 
  25. ^ Ковесди, Я; Хедли, SJ (август 2010 г.). «Клетки-продуценты аденовирусов». Вирусы . 2 (8): 1681–703. дои : 10.3390/v2081681 . ПМК 3185730 . ПМИД  21994701. 
  26. ^ Фанелли А (2016). «Клеточная линия HEK293: клетки эмбриональной почки человека» . Проверено 3 декабря 2017 г.
  27. ^ Даутценберг FM, Хигелин Дж, Тейхерт У (февраль 2000 г.). «Функциональная характеристика рецептора кортикотропин-рилизинг-фактора типа 1, эндогенно экспрессируемого в клетках эмбриональной почки человека 293». Европейский журнал фармакологии . 390 (1–2): 51–9. дои : 10.1016/S0014-2999(99)00915-2. ПМИД  10708706.
  28. ^ Мейер цу Херингдорф Д., Ласс Х., Кучар И., Липински М., Алемани Р., Руменапп У., Якобс К.Х. (март 2001 г.). «Стимуляция внутриклеточной продукции сфингозин-1-фосфата с помощью G-белковых рецепторов сфингозин-1-фосфата». Европейский журнал фармакологии . 414 (2–3): 145–54. дои : 10.1016/S0014-2999(01)00789-0. ПМИД  11239914.
  29. ^ Луо Дж., Бусильо Дж.М., Бенович Дж.Л. (август 2008 г.). «Передача сигналов, опосредованная мускариновым ацетилхолиновым рецептором M3, регулируется различными механизмами». Молекулярная фармакология . 74 (2): 338–47. дои : 10.1124/моль.107.044750. ПМК 7409535 . ПМИД  18388243. 
  30. ^ Заграничная Т.К., Ву X, Вильреал М.Л. (август 2005 г.). «Эндогенные белки TRPC1, TRPC3 и TRPC7 объединяются, образуя нативные депо-управляемые каналы в клетках HEK-293». Журнал биологической химии . 280 (33): 29559–69. дои : 10.1074/jbc.M505842200 . ПМИД  15972814.
  31. ^ Вонг А (2006). «Этика HEK 293». Национальный католический ежеквартальный журнал по биоэтике . 6 (3): 473–95. дои : 10.5840/ncbq20066331. ПМИД  17091554.
  32. ^ аб Шорр I (20 декабря 2020 г.). «Факты о вакцинах против COVID и линиях фетальных клеток». Национальное обозрение.
  33. ^ «Balkan Insight: Tulpina religioasă и антивакцинизм распространились в Центральной Европе и Восточной Европе - International - HotNews.ro» . 20 января 2021 г.
  34. ^ РЕЛИГИОЗНЫЙ ШТАММ АНТИ-ВАКС РАСТЕТ В ЦВЕ, balkaninsight.com
  35. ^ "Nota della Congregazione per la Dottrina della Fede sullamoralità dell'uso di alcuni vaccini anti-Covid-19" . press.vatican.va . Проверено 6 марта 2024 г.
  36. ↑ Рахман Дж. (26 ноября 2020 г.). «В вакцине AstraZeneca Covid-19 нет эмбриональных клеток». Полный факт.
  37. ↑ Регаладо, Антонио (7 октября 2020 г.). «Лечение Трампа антителами было протестировано с использованием клеток, полученных в результате аборта». Обзор технологий Массачусетского технологического института . Проверено 30 сентября 2021 г. Это то, как вы хотите это анализировать», — говорит Александра Боуи, представитель Regeneron. «Но доступные сегодня клеточные линии 293T не считаются эмбриональной тканью.
  38. ^ Циммерман, Ричард К. (13 июля 2021 г.). «Помощь пациентам с этическими опасениями по поводу вакцин против COVID-19 с учетом линий клеток плода, используемых в некоторых вакцинах против COVID-19». Вакцина . 39 (31): 4242–4244. doi : 10.1016/j.vaccine.2021.06.027. ISSN  1873-2518. ПМК 8205255 . ПМИД  34172329. 

Внешние ссылки

Викискладе есть медиафайлы, связанные с клетками HEK293 .