stringtranslate.com

Пятно Хехста

Химическая структура красителей Hoechst

Красители Хёхста относятся к семейству синих флуоресцентных красителей , используемых для окрашивания ДНК . [1] [2] Эти бис-бензимиды были первоначально разработаны компанией Hoechst AG , которая пронумеровала все свои соединения так, что краситель Hoechst 33342 является 33 342-м соединением, производимым компанией. Существует три родственных красителя Hoechst: Hoechst 33258, Hoechst 33342 и Hoechst 34580. Красители Hoechst 33258 и Hoechst 33342 являются наиболее часто используемыми и имеют схожие спектры возбуждения - эмиссии .

Молекулярные характеристики

Спектры возбуждения-эмиссии красителей Hoechst

Оба красителя возбуждаются ультрафиолетовым светом с длиной волны около 350  нм , и оба излучают сине-голубой флуоресцентный свет в районе максимума спектра излучения при 461 нм. Максимальное излучение флуоресценции несвязанного красителя приходится на диапазон 510–540 нм. Пятна Хехста можно возбуждать ксеноновой или ртутно-дуговой лампой или ультрафиолетовым лазером . Существует значительный стоксов сдвиг между спектрами возбуждения и излучения, что делает красители Hoechst полезными в экспериментах, в которых используются несколько флуорофоров . Интенсивность флуоресценции красителей Hoechst также увеличивается с увеличением pH растворителя . [3]

Красители Hoechst растворимы в воде и органических растворителях , таких как диметилформамид или диметилсульфоксид . Концентрации могут достигать до 10 мг/мл. Водные растворы стабильны при температуре 2–6 °C в течение не менее шести месяцев в защищенном от света месте. Для длительного хранения растворы вместо этого замораживают при температуре -20 ° C или ниже. [3]

Hoechst 33258 (пурпурный), связанный с малой бороздкой ДНК (зеленый и синий). Из PDB : 264D ​.

Красители связываются с малой бороздкой двухцепочечной ДНК, отдавая предпочтение последовательностям, богатым аденином и тимином . Хотя красители могут связываться со всеми нуклеиновыми кислотами, богатые АТ двухцепочечные цепи ДНК значительно усиливают флуоресценцию. [4] Красители Hoechst проницаемы для клеток и могут связываться с ДНК в живых или фиксированных клетках . Таким образом, эти пятна часто называют суправитальными , что означает, что живые клетки выдерживают обработку этими соединениями. Клетки, которые экспрессируют специфические белки- переносчики АТФ-связывающей кассеты, также могут активно выводить эти пятна из своей цитоплазмы . [ нужна цитата ]

Приложения

Просвечивающее изображение клеток HeLa с наложением окрашивания Hoechst 33258 (синий). Крайняя левая клетка находится на стадии прометафазы митоза ; его хромосомы ярко флуоресцируют, поскольку содержат сильно уплотненную ДНК.
Флуоресцентное изображение культивируемых нейтрофилов, выделенных из венозной крови человека с болезнью Альцгеймера. Образец обрабатывали красителем Hoechst 33342, который используется для окрашивания ДНК. На снимке показано высвобождение ДНК нейтрофилом в виде туманной области в центре поля зрения, что указывает на спонтанную активацию образования нейтрофильных внеклеточных ловушек у больных АД, что обычно не наблюдается у здоровых партнеров.

Концентрация 0,1–12 мкг/мл обычно используется для окрашивания ДНК бактерий или клеток эукариот . Клетки окрашивают в течение 1–30 минут при комнатной температуре или 37 °C, а затем промывают для удаления несвязавшегося красителя. Зеленую флуоресценцию несвязанного красителя Хёхста можно наблюдать на образцах, окрашенных слишком большим количеством красителя или частично промытых. [3] Красители Hoechst часто используются в качестве заменителей другого красителя нуклеиновой кислоты, называемого DAPI .

Ключевые различия между красителями Hoechst и DAPI:

Hoechst 33342 и 33258 гасятся бромдезоксиуридином ( BrdU ), который обычно используется для обнаружения делящихся клеток. Hoechst 33342 демонстрирует в 10 раз большую клеточную проницаемость, чем H 33258. Клетки могут интегрировать BrdU во вновь синтезированную ДНК в качестве замены тимидина . Предполагается, что когда BrdU интегрируется в ДНК, бром деформирует малую бороздку, так что красители Hoechst не могут достичь своего оптимального сайта связывания. Связывание красителей Hoechst с BrdU-замещенной ДНК еще сильнее; однако флуоресценции не происходит. Красители Hoechst можно использовать с BrdU для мониторинга развития клеточного цикла . [7] [8]

Красители Hoechst обычно используются для окрашивания геномной ДНК в следующих целях:

Отток Hoechst также используется для изучения гемопоэтических и эмбриональных стволовых клеток. Поскольку эти клетки способны эффективно выводить краситель, их можно обнаружить с помощью проточной цитометрии в так называемой боковой популяции . Это делается путем пропускания флуоресценции, излучаемой возбужденным хёхстом, через красный и синий фильтры и построения графика красного и синего хёхста друг против друга. [ нужна цитата ]

Токсичность и безопасность

Поскольку пятна Хехста связываются с ДНК, они мешают репликации ДНК во время деления клеток . Следовательно, они потенциально мутагены и канцерогенны , поэтому при обращении с ними и их утилизации следует соблюдать осторожность. Окраска Хехста используется для сортировки спермы у домашнего скота и человека. Его безопасность обсуждается. [13] [14]

Смотрите также

Рекомендации

  1. ^ Латт, Ю.А.; Стеттен, Г; Юргенс, Луизиана; Уиллард, ХФ; Шер, компакт-диск (июль 1975 г.). «Последние разработки в области обнаружения синтеза дезоксирибонуклеиновой кислоты с помощью флуоресценции 33258 Hoechst». Журнал гистохимии и цитохимии . 23 (7): 493–505. дои : 10.1177/23.7.1095650 . ПМИД  1095650.
  2. ^ Латт, Ю.А.; Стеттен, Г. (январь 1976 г.). «Спектральные исследования 33258 Hoechst и родственных бисбензимидазольных красителей, полезных для флуоресцентного обнаружения синтеза дезоксирибонуклеиновой кислоты». Журнал гистохимии и цитохимии . 24 (1): 24–33. дои : 10.1177/24.1.943439 . ПМИД  943439.
  3. ^ abc "Пятна Hoechst" (PDF) . Инвитрогрен (Молекулярные зонды). Архивировано из оригинала (PDF) 19 апреля 2009 г.
  4. ^ Португалия, Дж; Уоринг, MJ (28 февраля 1988 г.). «Назначение сайтов связывания ДНК для 4',6-диамидин-2-фенилиндола и бисбензимида (Hoechst 33258). Сравнительное исследование следа». Biochimica et Biophysical Acta (BBA) – Структура и экспрессия генов . 949 (2): 158–68. дои : 10.1016/0167-4781(88)90079-6. ПМИД  2449244.
  5. ^ BD Bioscience (2009). Методы анализа иммунной функции (PDF) (2-е изд.). Бектон, Дикинсон и компания.
  6. ^ Буцявичюс, Йонас; Лукинавичюс, Гражвидас; Герасимайте, Рута (18 апреля 2018 г.). «Использование красителей Hoechst для окрашивания ДНК и не только». Хемосенсоры . 6 (2): 18. doi : 10.3390/chemosensors6020018 . hdl : 21.11116/0000-0001-A4FE-8 . ISSN  2227-9040.
  7. ^ Куббис, М; Рабинович, П.С. (январь 1983 г.). «Проточный цитометрический анализ факторов, влияющих на эффект тушения BrdUrd-Hoechst в культивируемых человеческих фибробластах и ​​лимфоцитах». Цитометрия . 3 (4): 276–81. дои : 10.1002/cyto.990030408 . ПМИД  6185287.
  8. ^ Бреузегем, Ю.Ю.; Клегг, Р.М.; Лунтьенс, ФГ (1 февраля 2002 г.). «Специфичность базовых последовательностей связывания Hoechst 33258 и DAPI с пятью (A/T)4 сайтами ДНК с кинетическими данными для более чем одного высокоаффинного комплекса Hoechst 33258-AATT». Журнал молекулярной биологии . 315 (5): 1049–61. дои : 10.1006/jmbi.2001.5301. ПМИД  11827475.
  9. ^ Иэн Джонсон, Мишель Т.З. Спенс, изд. (2011). Справочник по молекулярным зондам: Руководство по флуоресцентным зондам и технологиям маркировки (11-е изд.). Инвитроген. ISBN 978-0-9829279-1-5.
  10. ^ Куббис, М (1990). «Проточно-цитометрическое распознавание вызванного кластогеном повреждения хроматина в лимфоцитах G0/G1 путем нестехиометрического связывания флуорохрома Хехста». Цитометрия . 11 (3): 386–94. дои : 10.1002/cyto.990110309 . ПМИД  1692786.
  11. ^ Аб Мочарла, Р.; Мочарла, Х; Ходс, Мэн (23 декабря 1987 г.). «Новый чувствительный метод флуорометрического окрашивания для обнаружения ДНК в препаратах РНК». Исследования нуклеиновых кислот . 15 (24): 10589. doi :10.1093/nar/15.24.10589. ПМЦ 339970 . ПМИД  2447564. 
  12. ^ Стерзель, В; Бедфорд, П; Эйзенбранд, Г. (июнь 1985 г.). «Автоматическое определение ДНК с использованием флуорохрома Hoechst 33258». Аналитическая биохимия . 147 (2): 462–7. дои : 10.1016/0003-2697(85)90299-4. ПМИД  2409841.
  13. ^ Эшвуд-Смит, MJ (1994). «Безопасность отбора спермы человека методом проточной цитометрии». Репродукция человека . 9 (5). Издательство Оксфордского университета : 757–759. doi : 10.1093/oxfordjournals.humrep.a138589. ПМИД  7929716.
  14. ^ Паррилла, я; Васкес, Х.М.; Куэльо, К; Гил, Массачусетс; Рока, Дж; Ди Берардино, защитник; Мартинес, Э.А. (2004). «Окрашивание Hoechst 33342 и воздействие ультрафиолетового лазера не вызывают генотоксических эффектов в сперматозоидах хряка, отсортированных методом проточной сортировки». Размножение . 128 (5): 615–621. дои : 10.1530/rep.1.00288 . ПМИД  15509707.

Внешние ссылки

На Wikimedia Commons есть СМИ, связанные с пятнами Хехста .