Криофиксация

Криофиксация — это метод фиксации или стабилизации биологических материалов как первый этап подготовки образцов для электронной и криоэлектронной микроскопии . ^[1] Типичные образцы для криофиксации включают небольшие образцы тканей растений или животных , клеточные суспензии микроорганизмов или культивируемых клеток , суспензии вирусов или вирусных капсидов и образцы очищенных макромолекул , особенно белков . ^{[2] [3]}

Типы криофиксации ^{[ нужна ссылка ] [ нужны разъяснения ]}

1. Сублимационная сушка ^{[ нужна ссылка ]}

2. Замораживание-замещение ^{[ нужна ссылка ]}

3. травление замораживанием ^{[ нужна ссылка ] [ нужны разъяснения ]}

Погружная заморозка

Этот метод включает сверхбыстрое охлаждение небольших образцов тканей или клеток до температуры жидкого азота (-196 ° C) или ниже, остановку любого движения и метаболической активности и сохранение внутренней структуры путем замораживания всех жидких фаз в твердом состоянии. Обычно образец погружают в жидкий азот или жидкий этан или жидкий пропан в контейнере, охлаждаемом жидким азотом. Конечная цель состоит в том, чтобы заморозить образец так быстро (при температуре от 10 ⁴ до 10 ⁶ К в секунду), чтобы кристаллы льда не смогли образоваться или не смогли вырасти достаточно большими, чтобы вызвать повреждение ультраструктуры образца . Формирование образцов, содержащих образцы в аморфном льду, является « Святым Граалем » биологической криомикроскопии. ^{[ нужна цитата ]}

На практике очень трудно достичь достаточно высоких скоростей охлаждения для получения аморфного льда в образцах толщиной более нескольких микрометров . С этой целью погружение образца в жидкий азот при температуре его кипения (-196 °С) ^[4] не всегда приводит к достаточно быстрому замораживанию образца по нескольким причинам. Во-первых, жидкий азот быстро кипит вокруг образца, образуя пленку изолирующего N.
₂газ, который замедляет передачу тепла к криогенной жидкости, известный как эффект Лейденфроста . Скорость охлаждения можно улучшить, откачивая жидкий азот с помощью пластинчато-роторного вакуумного насоса в течение нескольких десятков секунд перед погружением в него образца. Это снижает температуру жидкого азота ниже точки кипения, так что, когда образец погружается в него, он плотно окутывает образец на короткий период времени и более эффективно отводит от него тепло. Еще более быстрое охлаждение можно получить, погружая образцы в жидкий пропан или этан (этан оказался более эффективным) ^[5] и охлаждая их очень близко к температуре плавления с помощью жидкого азота ^[6] или ударяя образец о полированный жидкий азот. -охлаждаемые металлические поверхности из меди или серебра . ^[7] Во-вторых, два свойства самой воды предотвращают быструю криофиксацию крупных образцов. ^[8] Теплопроводность льда очень низкая по сравнению с теплопроводностью металлов , а вода при замерзании выделяет скрытую теплоту плавления , предотвращая быстрое охлаждение образцов толщиной более нескольких микрометров.

Замораживание под высоким давлением

Высокое давление помогает предотвратить образование крупных кристаллов льда. В технологии быстрой заморозки под собственным давлением (SPRF), в которой можно использовать множество различных криогенов, недавно рекламировалась как привлекательная и недорогая альтернатива заморозке под высоким давлением (HPF). ^[9] Холодный азот под давлением заменяет этанол при температуре примерно 123К. Теплый этанол затем выбрасывается замерзающим LN2 и, скорее всего, образует смесь этанола и азота, которая постепенно становится все холоднее и холоднее.

^[10]

Сублимационной сушки

При правильной сублимационной сушке время сушки сокращается на 30%. ^[11]

Смотрите также

• Криоконсервация
• Сублимационной сушки

Рекомендации

1. Пилхофер, Мартин; Ладинский, Марк С.; Макдауэлл, Аласдер В.; Дженсен, Грант Дж. (2010). Бактериальный ТЭМ . Методы клеточной биологии. Том. 96. стр. 21–45. дои : 10.1016/S0091-679X(10)96002-0. ISBN 9780123810076. ISSN  0091-679X. ПМИД  20869517.
2. Эхлин П. (1992). Низкотемпературная микроскопия и анализ . Нью-Йорк: Издательская корпорация Plenum.
3. Дюбоше Дж., Адриан М., Чанг Дж. Дж., Хомо Дж. К., Лепо Дж., Макдауэлл А. В., Шульц П. (1988). «Криоэлектронная микроскопия остеклованных образцов» (PDF) . Ежеквартальные обзоры биофизики . 21 (2): 129–228. дои : 10.1017/s0033583500004297. PMID  3043536. S2CID  2741633.
4. Баттерсби Б.Дж., Шарп Дж.К., Уэбб Р.И., Барнс Г.Т. (1994). «Витрификация водных суспензий в контролируемой среде для электронной микроскопии: улучшенное устройство погружного охлаждения». Журнал микроскопии . 176 (2): 110–120. doi :10.1111/j.1365-2818.1994.tb03505.x. S2CID  95926972.
5. Райан, Кейт П. (1992). «Криофиксация тканей для электронной микроскопии: обзор методов погружного охлаждения» (PDF) . Сканировать. Микроск . 6 (3): 715–743.
6. Лысый ВБ (1984). «Относительная эффективность криогенных жидкостей, используемых для быстрого охлаждения криогенных образцов». Журнал микроскопии . 134 (3): 261–270. doi :10.1111/j.1365-2818.1984.tb02519.x. S2CID  97233738.
7. Эллисон Д.П., Доу К.С., Рорвик MC (1987). «Создание и работа простого и недорогого устройства для замораживания для электронной микроскопии». Журнал микроскопии . 147 (Часть 1): 103–108. doi :10.1111/j.1365-2818.1987.tb02822.x. PMID  3305955. S2CID  112876.
8. Лысый ВБ (1987). Количественная криофиксация . Бристоль и Филадельфия: Адам Хилгер.
9. Леуниссен Ян Л.М. и Йи Х. (2009). «Быстрое замораживание под давлением (SPRF): новый метод криофиксации для подготовки образцов в электронной микроскопии». Дж. Микроск . 235 (1): 25–35. дои : 10.1111/j.1365-2818.2009.03178.x. PMID  19566624. S2CID  205342519. Архивировано из оригинала 5 января 2013 г.
10. Студер, Д. (сентябрь 1995 г.). «Витрификация суставного хряща методом замораживания под высоким давлением». Журнал микроскопии . 179 (3): 321–322. doi :10.1111/j.1365-2818.1995.tb03648.x. PMID  7473694. S2CID  32347571.
11. Сильва, ACC; Шмидт, ФК (01.10.2019). «Вакуумная заморозка экстракта кофе в различных технологических условиях». Пищевые и биотехнологические технологии . 12 (10): 1683–1695. doi : 10.1007/s11947-019-02314-x. ISSN  1935-5149. S2CID  201644501.