Лентивирусные векторы в генной терапии — это метод, с помощью которого гены могут быть вставлены, изменены или удалены в организмах с использованием лентивирусов .
Лентивирусы — это семейство вирусов , вызывающих такие заболевания, как СПИД , которые заражают путем вставки ДНК в геном клеток-хозяев . [1] Многие такие вирусы стали основой исследований с использованием вирусов в генной терапии, но лентивирус уникален своей способностью заражать неделящиеся клетки, и поэтому имеет более широкий спектр потенциальных применений. [2] Лентивирусы могут стать эндогенными (ERV), интегрируя свой геном в геном зародышевой линии хозяина, так что вирус отныне наследуется потомками хозяина. Ученые используют механизмы заражения лентивируса для достижения желаемого результата генной терапии. Пионером в генной терапии был Луиджи Нальдини . [3] [4]
Лентивирус является ретровирусом , то есть имеет одноцепочечный РНК- геном с ферментом обратной транскриптазы. Лентивирусы также имеют вирусную оболочку с выступающими гликопротеинами , которые помогают прикрепляться к внешней мембране клетки-хозяина. Вирус содержит молекулу обратной транскриптазы, которая, как было обнаружено, выполняет транскрипцию вирусного генетического материала при попадании в клетку. Внутри вирусного генома находятся последовательности РНК, которые кодируют специфические белки, которые облегчают включение вирусных последовательностей в геном клетки-хозяина. Ген «gag» кодирует структурные компоненты вирусных нуклеокапсидных белков: матричный (MA/p17), капсидный (CA/p24) и нуклеокапсидный (NC/p7) белки. Домен «pol» кодирует ферменты обратной транскриптазы и интегразы. Наконец, домен «env» вирусного генома кодирует гликопротеины и оболочку на поверхности вируса. [1] [ необходима полная цитата ]
Инфекция и репликация лентивируса в клетке-хозяине включает несколько этапов. На первом этапе вирус использует свои поверхностные гликопротеины для прикрепления к внешней поверхности клетки. А именно, лентивирусы прикрепляются к гликопротеинам CD4 на поверхности целевой клетки-хозяина. Затем вирусный материал вводится в цитоплазму клетки-хозяина. Внутри цитоплазмы фермент вирусной обратной транскриптазы выполняет обратную транскрипцию вирусного генома РНК для создания вирусного генома ДНК. Затем вирусная ДНК отправляется в ядро клетки-хозяина, где она включается в геном клетки-хозяина с помощью вирусного фермента интегразы . С этого момента клетка-хозяин начинает транскрибировать всю вирусную РНК и экспрессировать структурные вирусные белки, в частности те, которые образуют вирусный капсид и оболочку. Затем лентивирусная РНК и вирусные белки собираются, и новообразованные вирионы покидают клетку-хозяина , когда их образуется достаточно. [ необходима цитата ]
Было предложено два метода генной терапии с использованием лентивирусов. В методологии ex vivo клетки извлекаются из пациента, а затем культивируются. Лентивирусный вектор, несущий терапевтические трансгены, затем вводится в культуру для их инфицирования. Теперь модифицированные клетки продолжают культивироваться до тех пор, пока их не удастся ввести пациенту. Генная терапия in vivo представляет собой инъекцию образца вирусных векторов, содержащих трансгены, пациенту. [5]
Лентивирусы модифицированы, чтобы действовать как вектор для внедрения полезных генов в клетки. В отличие от других ретровирусов, которые не могут проникать через ядерную оболочку и, следовательно, могут действовать на клетки только во время митоза , лентивирусы могут инфицировать клетки независимо от того, делятся они или нет (показано, что это в значительной степени связано с капсидным белком). [6] Многие типы клеток, такие как нейроны , не делятся во взрослых организмах, поэтому лентивирусная генная терапия является хорошим кандидатом для лечения состояний, которые поражают эти типы клеток. [7]
Некоторые экспериментальные применения лентивирусных векторов [8] были реализованы в генной терапии с целью лечения таких заболеваний, как сахарный диабет , мышиная гемофилия А, рак предстательной железы , хроническое гранулематозное заболевание и сосудистые заболевания . [ необходима ссылка ]
Лентивирусные векторы, полученные из ВИЧ, широко разрабатывались из-за их способности воздействовать на определенные гены через коактиватор PSIP1 . [9] Эта специфичность цели позволяет разрабатывать лентивирусные генные векторы, которые не несут риска случайной вставки себя в нормально функционирующие гены. Поскольку ВИЧ является патогенным, его необходимо генетически модифицировать, чтобы удалить его болезнетворные свойства и способность к саморепликации. Этого можно достичь путем удаления вирусных генов, которые не нужны для трансдукции терапевтических трансгенов. Было высказано предположение, что путем воздействия на домены «gag» и «env» можно удалить достаточную часть генома ВИЧ-1 без потери его эффективности в генной терапии, при этом минимизируя вирусные гены, интегрированные в пациента. [10] Гены также могут быть заменены, а не разрушены, как еще один метод снижения рисков, связанных с использованием ВИЧ-1. [7]
Другие лентивирусы, такие как вирус иммунодефицита кошек [11] и вирус инфекционной анемии лошадей [12], были разработаны для использования в генной терапии и представляют интерес из-за неспособности вызывать серьезные заболевания у людей-хозяев. В частности, было показано, что вирус инфекционной анемии лошадей ведет себя несколько лучше, чем ВИЧ-1, в гемопоэтических стволовых клетках [13]
Исторически лентивирусные векторы включали сильные вирусные промоторы, которые имели побочный эффект инсерционного мутагенеза , мутации ядерной ДНК, которые влияют на функцию гена. [14] Было показано, что эти сильные вирусные промоторы являются основной причиной образования рака . [14] В результате вирусные промоторы были заменены клеточными промоторами и регуляторными последовательностями. [14]
Как уже упоминалось, лентивирусы обладают уникальной способностью инфицировать неделящиеся клетки. Помимо этого, есть несколько других свойств, которые отличают лентивирусные векторы от других вирусных векторов. Такие свойства важно учитывать при определении того, подходят ли лентивирусы для данного лечения.
Гаммаретровирусы являются ретровирусами, как и лентивирусы. Вирусы лейкемии мышей (MLV) были одними из первых, которые были исследованы на предмет их использования в генной терапии. Однако недавние исследования отдали предпочтение лентивирусам за их способность интегрироваться в неделящиеся клетки. Более практично, гаммаретровирусы имеют сродство к интеграции вблизи промоторов онкогенов , что приводит к неблагоприятному риску опухолей. [15] MLV могут быть репликационно компетентными, то есть они могут реплицироваться в клетке-хозяине. Эти репликационно-компетентные вирусы обеспечивают стабильный перенос генов и специфическое нацеливание на опухоли и ткани. [16]
В генной терапии аденовирусы отличаются от лентивирусов во многих отношениях, некоторые из которых обеспечивают преимущества по сравнению с лентивирусами. Эффективность трансдукции выше у аденовирусов по сравнению с лентивирусами. [5] Во-вторых, большинство человеческих клеток имеют рецепторы для аденовирусов [17], вероятно, в результате большого разнообразия аденовирусных заболеваний у людей. Однако это представляет собой недостаток [ editorializing ] - поскольку аденовирусы часто заражают людей, это создает иммунный ответ в организме. Такой ответ может снизить эффективность терапии аденовирусными векторами и может привести к побочным реакциям, таким как воспаление тканей. [18] Были проведены исследования для использования этого иммунного ответа для нацеливания на раковые клетки и разработки вакцин. [19] Гибридные аденовирусы-ретровирусы (в частности MLV) также были разработаны для использования преимуществ MLV и аденовирусов. [20]
Вариант тяжелого комбинированного иммунодефицита (SCID) с дефицитом ADA был успешно вылечен в многолетнем исследовании, опубликованном в 2021 году. Более 95% пролеченных пациентов продолжали оставаться без событий через 36 месяцев, и 100% пациентов пережили это обычно летальное заболевание. Самоинактивирующийся лентивирусный вектор EFS-ADA LV использовался для вставки функционального гена ADA в аутологичные гемопоэтические стволовые и прогениторные клетки CD34+ (HSPC). [21]
В исследовании, разработанном для улучшения результатов сосудистой трансплантации посредством генной терапии эндотелиальных клеток сосудов, третье поколение лентивируса показало свою эффективность в доставке генов к умеренным венозным трансплантатам и трансплантатам в таких процедурах, как аортокоронарное шунтирование. Поскольку вирус был адаптирован для потери большей части своего генома, вирус становится более безопасным и эффективным в трансплантации требуемых генов в клетку-хозяина. Недостаток этой терапии объясняется в исследовании тем, что долгосрочная экспрессия генов может потребовать использования промоторов и может способствовать большей трансгенной экспрессии. Исследователи достигли этого путем добавления самоинактивирующихся плазмид и создания более универсального тропизма путем псевдотипирования гликопротеина вируса везикулярного стоматита. [22]
При хронической гранулематозной болезни (ХГБ) иммунная функция является недостаточной в результате мутаций в компонентах фермента никотинамидадениндинуклеотидфосфатоксидазы ( НАДФН-оксидазы ) в фагоцитарных клетках, который катализирует выработку супероксидных свободных радикалов. Если этот фермент становится дефицитным, фагоциты не могут эффективно убивать поглощенные бактерии, поэтому могут образовываться гранулемы . Исследование, проведенное на мышах, подчеркивает использование специфичных для линии лентивирусных векторов для экспрессии нормальной версии одного из мутантных белков ХГБ, что позволяет лейкоцитам теперь производить функциональную версию НАДФН-оксидазы. Ученые разработали этот штамм лентивируса путем трансинфекции клеток 293T псевдотипированным вирусом с белком G везикулярного стоматита. Ответственность вирусного вектора заключалась в увеличении выработки функционального гена НАДФН-оксидазы в этих фагоцитарных клетках. Они сделали это, чтобы создать сродство к миелоидным клеткам. [23]
При раке простаты лентивирус трансформируется, связываясь с трастузумабом , чтобы прикрепиться к чувствительным к андрогенам линиям клеток LNCaP и кастрационно-устойчивым линиям клеток рака простаты человека C4-2. Эти две клетки в первую очередь отвечают за секрецию избыточного рецептора человеческого эпидермального фактора роста 2 ( HER-2 ), который является гормоном, связанным с раком простаты. Прикрепляясь к этим клеткам и изменяя их геномы, лентивирус может замедлять и даже убивать клетки, вызывающие рак. Исследователи вызвали специфичность вектора, манипулируя Fab-областью вирусного генома и псевдотипируя его с помощью вируса Синдбис. [24]
Гемофилия А также изучалась в генной терапии с использованием лентивирусного вектора на мышах. Вектор нацелен на гемопоэтические клетки, чтобы увеличить количество фактора VIII, который поражается при гемофилии А. Но это продолжает оставаться предметом изучения, поскольку лентивирусный вектор не был полностью успешным в достижении этой цели. Они сделали это путем трансинфекции вируса в клетке 293T, создав вирус, известный как 2bF8, экспрессирующий поколение вирусных векторов. [25]
Исследования также показали, что инъекция лентивирусного вектора с генами, экспрессирующими ИЛ-10 in utero, у мышей может подавлять и предотвращать ревматоидный артрит и создавать новые клетки с постоянной экспрессией генов. Это вносит вклад в данные о стволовых клетках и внутриутробной инокуляции вирусных векторов для генной терапии. Целью вирусного вектора в этом исследовании были синовиальные клетки. Нормально функционирующие синовиальные клетки продуцируют TNFα и ИЛ-1 . [26]
Как и многие исследования in utero, лентивирусная векторная генная терапия сахарного диабета более эффективна in utero, поскольку стволовые клетки, на которые воздействует генная терапия, создают новые клетки с новым геном, созданным фактическим вирусным вмешательством. Вектор нацелен на клетки поджелудочной железы, чтобы добавить гены, секретирующие инсулин, чтобы помочь контролировать сахарный диабет. Векторы были клонированы с использованием промотора цитомегаловируса , а затем ко-трансфицированы в клетке 293T. [27]
Поскольку зрелые нейроны не делятся, лентивирусы идеально подходят для генной терапии, независимой от деления. Исследования лентивирусной генной терапии проводились на пациентах с прогрессирующей болезнью Паркинсона [28] и атрофией нейронов, связанной со старением, у приматов. [29]