stringtranslate.com

ДНК-лигаза

ДНК-лигаза — это тип фермента, который облегчает соединение цепей ДНК , катализируя образование фосфодиэфирной связи . Он играет роль в восстановлении одноцепочечных разрывов в дуплексной ДНК в живых организмах, но некоторые формы (например, ДНК-лигаза IV ) могут специально восстанавливать двухцепочечные разрывы (т. е. разрыв в обеих комплементарных цепях ДНК). Одноцепочечные разрывы восстанавливаются ДНК-лигазой с использованием комплементарной цепи двойной спирали в качестве матрицы [1] , при этом ДНК-лигаза создает конечную фосфодиэфирную связь для полного восстановления ДНК.

ДНК-лигаза используется как при репарации ДНК , так и при репликации ДНК (см. Лигазы млекопитающих ). Кроме того, ДНК-лигаза широко используется в лабораториях молекулярной биологии для экспериментов с рекомбинантной ДНК (см. Исследовательские применения ). Очищенная ДНК-лигаза используется при клонировании генов для соединения молекул ДНК вместе с образованием рекомбинантной ДНК .

Ферментативный механизм

Изображение демонстрирует, как лигаза (желтый овал) катализирует две нити фрагментов ДНК. Лигаза соединяет два фрагмента ДНК, образуя более длинную нить ДНК, «склеивая» их вместе.

Механизм ДНК-лигазы заключается в образовании двух ковалентных фосфодиэфирных связей между 3'-гидроксильными концами одного нуклеотида («акцептор») и 5'-фосфатным концом другого («донор»). Для образования каждой фосфодиэфирной связи расходуются две молекулы АТФ. [ необходима цитата ] Для реакции лигазы, которая протекает в четыре этапа, требуется АМФ:

  1. Реорганизация участка активности, например, разрывы в сегментах ДНК или фрагменты Оказаки и т. д.
  2. При аденилировании (присоединении АМФ) остатка лизина в активном центре фермента высвобождается пирофосфат ;
  3. Перенос АМП на 5'-фосфат так называемого донора, образование пирофосфатной связи;
  4. Образование фосфодиэфирной связи между 5'-фосфатом донора и 3'-гидроксилом акцептора. [2]
Наглядный пример работы лигазы (с липкими концами )

Лигаза также будет работать с тупыми концами , хотя для этого потребуются более высокие концентрации фермента и другие условия реакции.

Типы

кишечная палочка

ДНК-лигаза E. coli кодируется геном lig . ДНК-лигаза в E. coli , как и в большинстве прокариот, использует энергию, получаемую при расщеплении никотинамидадениндинуклеотида (НАД), для создания фосфодиэфирной связи. [3] Она не лигирует ДНК с тупыми концами, за исключением условий молекулярной скученности с полиэтиленгликолем , и не может эффективно соединять РНК с ДНК. [ требуется ссылка ]

Активность ДНК-лигазы E. coli может быть усилена ДНК-полимеразой при правильных концентрациях. Усиление работает только тогда, когда концентрации ДНК-полимеразы 1 намного ниже, чем фрагменты ДНК, которые нужно лигировать. Когда концентрации ДНК-полимераз Pol I выше, это оказывает неблагоприятное воздействие на ДНК-лигазу E. coli [4]

Т4

ДНК-лигаза из бактериофага T4 ( бактериофаг , который заражает бактерии Escherichia coli ). Лигаза T4 является наиболее часто используемой в лабораторных исследованиях. [5] Она может лигировать как липкие, так и тупые концы ДНК, олигонуклеотидов, а также РНК и гибридов РНК-ДНК, но не одноцепочечных нуклеиновых кислот. Она также может лигировать ДНК с тупыми концами с гораздо большей эффективностью, чем ДНК-лигаза E. coli . В отличие от ДНК-лигазы E. coli , ДНК-лигаза T4 не может использовать НАД и имеет абсолютную потребность в АТФ в качестве кофактора. Была проведена некоторая инженерия для улучшения активности ДНК-лигазы T4 in vitro ; Например, один успешный подход протестировал ДНК-лигазу T4, слитую с несколькими альтернативными ДНК-связывающими белками, и обнаружил, что конструкции с p50 или NF-kB в качестве партнеров слияния были более чем на 160% более активны в лигировании тупых концов для целей клонирования, чем ДНК-лигаза T4 дикого типа. [6] Типичная реакция для вставки фрагмента в плазмидный вектор будет использовать около 0,01 (липкие концы) до 1 (тупые концы) единиц лигазы. Оптимальная температура инкубации для ДНК-лигазы T4 составляет 16 °C. [ необходима цитата ]

Мутанты лигазы бактериофага Т4 обладают повышенной чувствительностью как к УФ- облучению [7] [8], так и к алкилирующему агенту метилметансульфонату [9], что указывает на то, что ДНК-лигаза участвует в восстановлении повреждений ДНК, вызванных этими агентами.

Млекопитающие

У млекопитающих существует четыре конкретных типа лигаз.

  1. ДНК-лигаза 1 : лигирует зарождающуюся ДНК отстающей цепи после того, как рибонуклеаза H удалила РНК-праймер из фрагментов Оказаки .
  2. ДНК-лигаза 3 : комплексы с белком репарации ДНК XRCC1 для помощи в запечатывании ДНК во время процесса эксцизионной репарации нуклеотидов и рекомбинантных фрагментов. Из всех известных ДНК-лигаз млекопитающих только лигаза 3 обнаружена в митохондриях.
  3. ДНК-лигаза 4 : комплексы с XRCC4 . Катализирует последний шаг в пути репарации разрыва двухцепочечной цепи ДНК с негомологичным соединением концов . Также требуется для рекомбинации V(D)J , процесса, который генерирует разнообразие в локусах иммуноглобулинов и рецепторов Т-клеток во время развития иммунной системы .

ДНК-лигаза эукариот и некоторых микробов использует аденозинтрифосфат (АТФ) вместо НАД. [3]

Термостабильный

Полученный из термофильной бактерии, фермент стабилен и активен при гораздо более высоких температурах, чем обычные ДНК-лигазы. Его период полураспада составляет 48 часов при 65 °C и более 1 часа при 95 °C. Было показано, что ДНК-лигаза амплигразы активна в течение не менее 500 термических циклов (94 °C/80 °C) или 16 часов циклирования. 10  Эта исключительная термостабильность обеспечивает чрезвычайно высокую строгость гибридизации и специфичность лигирования. [11]

Измерение активности

Для измерения активности ДНК-лигазы используются по крайней мере три различные единицы: [12]

Исследовательские приложения

ДНК-лигазы стали незаменимыми инструментами в современных исследованиях молекулярной биологии для создания рекомбинантных последовательностей ДНК. Например, ДНК-лигазы используются с ферментами рестрикции для вставки фрагментов ДНК, часто генов , в плазмиды .

Контроль оптимальной температуры является жизненно важным аспектом проведения эффективных экспериментов по рекомбинации, включающих лигирование фрагментов с когезионными концами. В большинстве экспериментов используется ДНК-лигаза T4 (выделенная из бактериофага T4 ), которая наиболее активна при 37 °C. [13] Однако для оптимальной эффективности лигирования с фрагментами с когезионными концами («липкие концы») оптимальная температура фермента должна быть сбалансирована с температурой плавления T m лигируемых липких концов, [14] гомологичное спаривание липких концов не будет стабильным, поскольку высокая температура нарушает водородные связи . Реакция лигирования наиболее эффективна, когда липкие концы уже стабильно отожжены, и нарушение отожженных концов, следовательно, приведет к низкой эффективности лигирования. Чем короче свес , тем ниже T m .

Поскольку у фрагментов ДНК с тупыми концами нет когезионно связанных концов для отжига, температура плавления не является фактором, который следует учитывать в пределах нормального температурного диапазона реакции лигирования. Ограничивающим фактором при лигировании с тупыми концами является не активность лигазы, а скорее количество выравниваний между концами фрагментов ДНК, которые происходят. Поэтому наиболее эффективной температурой лигирования для ДНК с тупыми концами будет температура, при которой может произойти наибольшее количество выравниваний. Большинство лигирований с тупыми концами проводятся при 14-25 °C в течение ночи. Отсутствие стабильно отожженных концов также означает, что эффективность лигирования снижается, что требует использования более высокой концентрации лигазы. [14]

Новое применение ДНК-лигазы можно увидеть в области нанохимии, в частности в ДНК-оригами. Принципы самосборки на основе ДНК оказались полезными для организации наномасштабных объектов, таких как биомолекулы, наномашины, наноэлектронные и фотонные компоненты. Сборка такой наноструктуры требует создания сложной сетки молекул ДНК. Хотя самосборка ДНК возможна без какой-либо внешней помощи с использованием различных субстратов, таких как предоставление кататонической поверхности алюминиевой фольги, ДНК-лигаза может обеспечить ферментативную помощь, которая требуется для создания решетчатой ​​структуры ДНК из свисающих ДНК. [15]

История

Первая ДНК-лигаза была очищена и охарактеризована в 1967 году лабораториями Геллерта, Лемана, Ричардсона и Гурвица. [16] Впервые она была очищена и охарактеризована Вайсом и Ричардсоном с использованием шестиступенчатого процесса хроматографического фракционирования, начинающегося с удаления клеточного детрита и добавления стрептомицина, за которым следовали несколько промывок колонок диэтиламиноэтил (DEAE)-целлюлозой и окончательное фракционирование фосфоцеллюлозы. Конечный экстракт содержал 10% активности, первоначально зарегистрированной в  среде E. coli  ; в ходе процесса было обнаружено, что АТФ и Mg++ необходимы для оптимизации реакции. Обычные коммерчески доступные ДНК-лигазы были первоначально обнаружены в бактериофаге T4 , E. coli и других бактериях . [17]

Расстройства

Генетические дефекты ДНК-лигаз человека связаны с клиническими синдромами, отмеченными иммунодефицитом, чувствительностью к радиации и аномалиями развития,  [16] Синдром LIG4 (синдром лигазы IV) является редким заболеванием, связанным с мутациями в ДНК-лигазе 4 и нарушающим механизмы репарации разрывов dsDNA. Синдром лигазы IV вызывает иммунодефицит у людей и обычно связан с микроцефалией и гипоплазией костного мозга. [18] Список распространенных заболеваний, вызванных отсутствием или неисправностью ДНК-лигазы, приведен ниже.

Пигментная ксеродерма

Пигментная ксеродерма , обычно известная как XP, является наследственным заболеванием, характеризующимся чрезвычайной чувствительностью к ультрафиолетовым (УФ) лучам солнечного света. Это заболевание в основном поражает глаза и участки кожи, подверженные воздействию солнца. У некоторых больных также наблюдаются проблемы с нервной системой. [19]

Атаксия-телеангиэктазия

Мутации в гене ATM вызывают  атаксию-телеангиэктазию . Ген ATM обеспечивает инструкции для создания белка, который помогает контролировать деление клеток и участвует в восстановлении ДНК. Этот белок играет важную роль в нормальном развитии и деятельности нескольких систем организма, включая нервную систему и иммунную систему. Белок ATM помогает клеткам распознавать поврежденные или разорванные нити ДНК и координирует восстановление ДНК, активируя ферменты, которые восстанавливают разорванные нити. Эффективное восстановление поврежденных нитей ДНК помогает поддерживать стабильность генетической информации клетки. У пораженных детей обычно возникают трудности с ходьбой, проблемы с равновесием и координацией рук, непроизвольные подергивания (хорея), мышечные подергивания (миоклонус) и нарушения нервной функции (невропатия). Проблемы с движением обычно приводят к тому, что к подростковому возрасту людям требуется помощь инвалидной коляски. Люди с этим расстройством также имеют невнятную речь и трудности с движением глаз, чтобы смотреть из стороны в сторону (окуломоторная апраксия). [20]

Анемия Фанкони

Анемия Фанкони (ФА) — редкое наследственное заболевание крови, которое приводит к недостаточности костного мозга. ФА не позволяет костному мозгу производить достаточно новых клеток крови для нормальной работы организма. ФА также может привести к тому, что костный мозг будет производить много дефектных клеток крови. Это может привести к серьезным проблемам со здоровьем, таким как лейкемия . [21]

синдром Блума

Синдром Блума приводит к тому, что кожа становится чувствительной к воздействию солнца, и обычно к появлению пятен покрасневшей кожи в форме бабочки на носу и щеках. Кожная сыпь может также появляться на других участках, которые обычно подвергаются воздействию солнца, таких как тыльная сторона ладоней и предплечья. В сыпи часто появляются небольшие скопления расширенных кровеносных сосудов (телеангиэктазии); телеангиэктазии также могут возникать в глазах. Другие особенности кожи включают пятна кожи, которые светлее или темнее окружающих участков (гипопигментация или гиперпигментация соответственно). Эти пятна появляются на участках кожи, которые не подвергаются воздействию солнца, и их развитие не связано с высыпаниями.

Как мишень для наркотиков

В недавних исследованиях ДНК-лигаза I человека использовалась в компьютерном дизайне лекарств для идентификации ингибиторов ДНК-лигазы в качестве возможных терапевтических агентов для лечения рака. [22] Поскольку чрезмерный рост клеток является отличительной чертой развития рака, целевая химиотерапия, которая нарушает функционирование ДНК-лигазы, может препятствовать адъювантным формам рака. Кроме того, было показано, что ДНК-лигазы можно в целом разделить на две категории, а именно, АТФ- и НАД + -зависимые. Предыдущие исследования показали, что хотя НАД + -зависимые ДНК-лигазы были обнаружены в спорадических клеточных или вирусных нишах за пределами бактериального домена жизни, нет ни одного случая, когда НАД + -зависимая лигаза присутствовала бы в эукариотическом организме. Присутствие исключительно в неэукариотических организмах, уникальная субстратная специфичность и отличительная структура домена НАД + -зависимых по сравнению с АТФ-зависимыми ДНК-лигазами человека вместе делают НАД + -зависимые лигазы идеальными мишенями для разработки новых антибактериальных препаратов. [16]

Смотрите также

Ссылки

  1. ^ Pascal JM, O'Brien PJ, Tomkinson AE, Ellenberger T (ноябрь 2004 г.). «ДНК-лигаза I человека полностью обхватывает и частично раскручивает никнированную ДНК». Nature . 432 (7016): 473–8. Bibcode :2004Natur.432..473P. doi :10.1038/nature03082. PMID  15565146. S2CID  3105417.
  2. ^ Lehman IR (ноябрь 1974 г.). «ДНК-лигаза: структура, механизм и функция». Science . 186 (4166): 790–7. Bibcode :1974Sci...186..790L. doi :10.1126/science.186.4166.790. PMID  4377758. S2CID  86549159.
  3. ^ ab Foster JB, Slonczewski J (2010). Микробиология: развивающаяся наука (второе изд.). Нью-Йорк: WW Norton & Company. ISBN 978-0-393-93447-2.
  4. ^ Yang Y, LiCata VJ (февраль 2018 г.). «ДНК-полимеразы Pol I стимулируют соединение концов ДНК ДНК-лигазой Escherichia coli». Biochemical and Biophysical Research Communications . 497 (1): 13–18. doi : 10.1016/j.bbrc.2018.01.165 . PMID  29409896.
  5. ^ "Лигазы" (PDF) . Руководство по ферментным ресурсам . Promega Corporation. стр. 8–14.
  6. ^ Wilson RH, Morton SK, Deiderick H, Gerth ML, Paul HA, Gerber I, Patel A, Ellington AD, Hunicke-Smith SP, Patrick WM (июль 2013 г.). «Сконструированные ДНК-лигазы с улучшенной активностью in vitro». Protein Engineering, Design & Selection . 26 (7): 471–8. doi : 10.1093/protein/gzt024 . PMID  23754529.
  7. ^ Baldy MW (1968). «Репарация и рекомбинация в фаге T4. II. Гены, влияющие на чувствительность к УФ-излучению». Симпозиумы по количественной биологии в Колд-Спринг-Харбор . 33 : 333–8. doi :10.1101/sqb.1968.033.01.038. PMID  4891973.
  8. ^ Baldy MW (февраль 1970 г.). «УФ-чувствительность некоторых чувствительных к температуре мутантов фага T4 с ранними функциями». Вирусология . 40 (2): 272–87. doi :10.1016/0042-6822(70)90403-4. PMID  4909413.
  9. ^ Baldy MW, Strom B, Bernstein H (март 1971). «Репарация алкилированной дезоксирибонуклеиновой кислоты бактериофага T4 с помощью механизма, включающего полинуклеотидлигазу». Журнал вирусологии . 7 (3): 407–8. doi :10.1128/JVI.7.3.407-408.1971. PMC 356131. ​​PMID  4927528 . 
  10. ^ Томкинсон, Алан Э.; Салмир, Аннахита (5 сентября 2013 г.). «Структура и функция ДНК-лигаз, кодируемых геном млекопитающих LIG3». Gene . 531 (2): 150–157. doi :10.1016/j.gene.2013.08.061. PMC 3881560 . PMID  24013086. 
  11. ^ "Амплигаза-термостабильная ДНК-лигаза". www.epibio.com . Архивировано из оригинала 2017-06-19 . Получено 2017-05-15 .
  12. ^ Russell DW, Sambrook J (2001). "Глава 1: Плазмиды и их полезность в молекулярном клонировании". Молекулярное клонирование: лабораторное руководство . Том 1 (3-е изд.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory. стр. 1–159. ISBN 978-0-87969-577-4.
  13. ^ Baneyx F, Lucotte G (1993). Введение в методы молекулярного клонирования . Чичестер: John Wiley & Sons. стр. 156. ISBN 978-0-471-18849-0.
  14. ^ ab Tabor S (май 2001). "ДНК-лигазы". Текущие протоколы в молекулярной биологии . Глава 3: Раздел 3.14. doi :10.1002/0471142727.mb0314s08. ISBN 978-0-471-14272-0. PMID  18265223. S2CID  23944826.
  15. ^ Bhanjadeo MM, Nayak AK, Subudhi U (2017). «Самосборка ДНК с помощью поверхности: стратегия без ферментов для формирования разветвленной решетки ДНК». Biochemical and Biophysical Research Communications . 485 (2): 492–498. doi :10.1016/j.bbrc.2017.02.024. PMID  28189681.
  16. ^ abc Shuman S (июнь 2009). «ДНК-лигазы: прогресс и перспективы». Журнал биологической химии . 284 (26): 17365–9. doi : 10.1074/jbc.R900017200 . PMC 2719376. PMID  19329793 . 
  17. ^ Weiss B, Richardson CC (апрель 1967 г.). «Ферментативный разрыв и соединение дезоксирибонуклеиновой кислоты, I. Ремонт одноцепочечных разрывов ДНК ферментной системой из Escherichia coli, инфицированной бактериофагом T4». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 57 (4): 1021–8. Bibcode : 1967PNAS...57.1021W. doi : 10.1073/pnas.57.4.1021 . PMC 224649. PMID  5340583 . 
  18. ^ Altmann T, Gennery AR (октябрь 2016 г.). «Синдром ДНК-лигазы IV; обзор». Orphanet Journal of Rare Diseases . 11 (1): 137. doi : 10.1186 /s13023-016-0520-1 . PMC 5055698. PMID  27717373. 
  19. ^ "xeroderma pigmentosum". Genetics Home Reference . Получено 2017-05-15 .
  20. ^ "атаксии-телеангиэктазии". Genetics Home Reference . Получено 2017-05-15 .
  21. ^ "Что такое анемия Фанкони?". NHLBI, NIH . Получено 15.05.2017 .
  22. ^ Tomkinson AE, Howes TR, Wiest NE (июнь 2013 г.). «ДНК-лигазы как терапевтические мишени». Translational Cancer Research . 2 (3). PMC 3819426. PMID 24224145  . 

Внешние ссылки