Флуоресцентная метка

Септины S. cerevisiae выявлены с помощью флуоресцентной микроскопии с использованием флуоресцентной маркировки

В молекулярной биологии и биотехнологии флуоресцентная метка , также известная как флуоресцентная метка или флуоресцентный зонд , представляет собой молекулу , которая химически прикрепляется для облегчения обнаружения биомолекулы, такой как белок, антитело или аминокислота. Обычно при флуоресцентном мечении или маркировке используется реакционноспособное производное флуоресцентной молекулы, известное как флуорофор . Флуорофор избирательно связывается с определенной областью или функциональной группой целевой молекулы и может быть присоединен химически или биологически. ^[1] Широко используются различные методы маркировки, такие как ферментативная маркировка, маркировка белков и генетическая маркировка. Бромид этидия , флуоресцеин и зеленый флуоресцентный белок являются обычными метками. Наиболее часто мечеными молекулами являются антитела, белки, аминокислоты и пептиды, которые затем используются в качестве специфических зондов для обнаружения конкретной мишени. ^[2]

История

Стоукс Джордж Дж.

Осаму Симомура-пресс-конференция, 6 декабря 2008 г.-1

Разработка методов обнаружения и идентификации биомолекул была мотивирована возможностью улучшить изучение молекулярной структуры и взаимодействий. До появления флуоресцентной маркировки радиоизотопы использовались для обнаружения и идентификации молекулярных соединений. С тех пор были разработаны более безопасные методы, включающие использование флуоресцентных красителей или флуоресцентных белков в качестве меток или зондов в качестве средства маркировки и идентификации биомолекул. ^[3] Хотя флуоресцентное мечение в этом отношении стало использоваться лишь недавно, открытие флуоресценции произошло гораздо раньше.

Сэр Джордж Стоукс разработал закон флуоресценции Стокса в 1852 году, который гласит, что длина волны флуоресцентного излучения больше, чем длина волны возбуждающего излучения. Затем Ричард Мейер в 1897 году назвал флуорофором , чтобы описать химическую группу, связанную с флуоресценцией. С тех пор флуоресцеин был создан как флуоресцентный краситель Адольфом фон Байером в 1871 году, а метод окрашивания был разработан и использован с развитием флуоресцентной микроскопии в 1911 году. ^[4]

Бромид этидия и его варианты были разработаны в 1950-х годах ^[4] , а в 1994 году были представлены флуоресцентные белки или ФП. ^[5] Зеленый флуоресцентный белок или GFP был открыт Осаму Шимомурой в 1960-х годах и разработан в качестве молекулы-индикатора Дугласом Прашером в 1987 году. ^[6] FP привели к прорыву в визуализации живых клеток с возможностью избирательно маркировать участки генетических белков. и наблюдать функции и механизмы белков. ^[5] За этот прорыв Симомура был удостоен Нобелевской премии в 2008 году. ^[7]

Разработаны новые методы отслеживания биомолекул, включая использование колориметрических биосенсоров, фотохромных соединений, биоматериалов и электрохимических сенсоров. Флуоресцентное мечение также является распространенным методом, применение которого расширилось до ферментативного мечения, химического мечения, мечения белков и генетического мечения. ^[1]

Виды биосенсоров

Методы отслеживания биомолекул

В настоящее время существует несколько методов маркировки для отслеживания биомолекул. Некоторые из методов включают следующее.

Изотопные маркеры

Общие виды, для которых используются изотопные маркеры, включают белки. В этом случае в полипептидные последовательности включаются аминокислоты со стабильными изотопами углерода, азота или водорода. ^[8] Эти полипептиды затем подвергаются масс-спектрометрии . Из-за точно определенных изменений, которые эти изотопы вызывают в пептидах, с помощью графика спектрометрии можно определить, какие пептиды содержат эти изотопы. Поступая таким образом, можно извлечь интересующий белок из нескольких других в группе. Изотопные соединения играют важную роль как фотохромы, описанные ниже.

Колориметрические биосенсоры

Биосенсоры прикрепляются к интересующему веществу. Обычно это вещество не способно поглощать свет, но с присоединенным биосенсором свет может поглощаться и излучаться на спектрофотометре . ^[9] Кроме того, флуоресцентные биосенсоры можно увидеть невооруженным глазом. Некоторые флуоресцентные биосенсоры также способны менять цвет в изменяющихся условиях (например, с синего на красный). Исследователь сможет проверять и получать данные об окружающей среде на основе того, какой цвет он или она сможет видеть визуально от гибридных видов биосенсора и молекулы. ^[10]

Колориметрические анализы обычно используются для определения концентрации одного вида по сравнению с другим. ^[9]

Фотохромные соединения

Фотохромные соединения обладают способностью переключаться между диапазоном или разнообразием цветов. Их способность отображать разные цвета зависит от того, как они поглощают свет. Молекула в разных изомерных проявлениях поглощает свет с разной длиной волны, так что каждый изомерный вид может отображать разный цвет в зависимости от своего поглощения. К ним относятся фотопереключаемые соединения, представляющие собой белки, способные переходить из нефлуоресцентного состояния в флуоресцентное в определенной среде. ^[11]

Наиболее распространенной органической молекулой, используемой в качестве фотохрома, является диарилэтен . ^[12] Другие примеры фотопереключаемых белков включают PADRON-C, rs-FastLIME-s и bs-DRONPA-s, которые можно использовать как в клетках растений, так и в клетках млекопитающих, чтобы наблюдать за перемещением клеток в разные среды. ^[11]

Биоматериалы

Флуоресцентные биоматериалы — возможный способ использования внешних факторов для более наглядного наблюдения за путем. Этот метод включает флуоресцентное мечение пептидных молекул, которые могут изменить естественный путь организма. Когда этот пептид вводится в клетку организма, он может вызвать другую реакцию. Этот метод можно использовать, например, для лечения пациента, а затем наглядно увидеть результат лечения. ^[13]

Электрохимические датчики

Электрохимические датчики можно использовать для определения биомолекул без меток. Они обнаруживают изменения и измеряют ток между зондируемым металлическим электродом и электролитом, содержащим целевой аналит. Затем к электроду подается известный потенциал по току обратной связи, и результирующий ток может быть измерен. Например, один из методов электрохимического зондирования включает медленное повышение напряжения, вызывающее окисление или восстановление химических веществ на электроде. На графике отображается зависимость тока ячейки от напряжения, что в конечном итоге позволяет определить количество химических веществ, потребляемых или производимых на электроде. ^[14] Флуоресцентные метки можно использовать в сочетании с электрохимическими датчиками для облегчения обнаружения в биологической системе.

Флуоресцентные этикетки

Экворея Виктория

Структура GFP

Из различных методов мечения биомолекул преимущества флуоресцентных меток заключаются в том, что они высокочувствительны даже при низких концентрациях и не разрушают сворачивание и функцию целевой молекулы. ^[1]

Зеленый флуоресцентный белок — это природный флуоресцентный белок медузы Aequorea victoria , который широко используется для мечения представляющих интерес белков. GFP излучает фотон в зеленой области светового спектра при возбуждении поглощением света. Хромофор состоит из окисленного трипептида -Ser^65-Tyr^66-Gly^67 , расположенного внутри β-цилиндра. GFP катализирует окисление и требует только молекулярного кислорода. GFP был модифицирован путем изменения длины волны поглощаемого света, чтобы включить другие цвета флуоресценции. YFP или желтый флуоресцентный белок , BFP или синий флуоресцентный белок и CFP или голубой флуоресцентный белок являются примерами вариантов GFP. Эти варианты производятся путем генной инженерии гена GFP. ^[15]

Синтетические флуоресцентные зонды также можно использовать в качестве флуоресцентных меток. К преимуществам этих этикеток относятся меньший размер и большее разнообразие цветов. Их можно использовать для более избирательного мечения интересующих белков с помощью различных методов, включая маркировку на основе химического распознавания, например, с использованием металл-хелатных пептидных меток, и маркировку на основе биологического распознавания с использованием ферментативных реакций. ^[16] Однако, несмотря на широкий спектр длин волн возбуждения и излучения, а также лучшую стабильность, синтетические зонды имеют тенденцию быть токсичными для клетки и поэтому обычно не используются в исследованиях клеточной визуализации. ^[1]

Флуоресцентные метки можно гибридизовать с мРНК, чтобы визуализировать взаимодействие и активность, например локализацию мРНК. Антисмысловая цепь, меченная флуоресцентным зондом, прикрепляется к одной цепи мРНК, и затем ее можно наблюдать во время развития клетки, чтобы увидеть движение мРНК внутри клетки. ^[17]

Флуорогенные этикетки

Флуоген — это лиганд (флуорогенный лиганд), который сам по себе не является флуоресцентным, но когда он связывается со специфическим белком или структурой РНК, становится флуоресцентным. ^[18]

Например, FAST — это вариант фотоактивного желтого белка , который был разработан для связывания химических имитаторов трипептидного хромофора GFP. ^[19] Аналогично, аптамер шпината представляет собой сконструированную последовательность РНК, которая может связывать химические имитаторы хромофора GFP, тем самым обеспечивая условную и обратимую флуоресценцию молекул РНК, содержащих эту последовательность. ^[20]

Использование меток при флуоресцентной маркировке

В прямом флуоресцентном тесте на антитела антитела химически связаны с флуоресцентным красителем.

FISH-изображение бифидобактерий Cy3

FISH-анализ синдрома Джорджа

Флуоресцентная маркировка известна своей неразрушающей способностью и высокой чувствительностью. Это сделало его одним из наиболее широко используемых методов маркировки и отслеживания биомолекул. ^[1] В зависимости от природы мишени можно использовать несколько методов флуоресцентного мечения.

Ферментативная маркировка

При ферментативном мечении сначала формируется конструкция ДНК с использованием гена и ДНК флуоресцентного белка. ^[21] После транскрипции образуется гибридная РНК + флуоресцентная. Объект интереса прикреплен к ферменту, который может распознавать эту гибридную ДНК. Обычно в качестве флуорофора используют флуоресцеин.

Химическая маркировка

Химическая маркировка или использование химических меток использует взаимодействие между небольшой молекулой и определенной генетической аминокислотной последовательностью. ^[22] Химическая маркировка иногда используется в качестве альтернативы GFP. Синтетические белки, которые действуют как флуоресцентные зонды, меньше, чем GFP, и поэтому могут функционировать как зонды в более широком спектре ситуаций. Более того, они предлагают более широкий спектр цветов и фотохимических свойств. ^[23] Учитывая недавние достижения в области химической маркировки, химические метки предпочтительнее флуоресцентных белков из-за ограничений по архитектуре и размеру характерного β-цилиндра флуоресцентного белка. Изменения флуоресцентных белков могут привести к потере флуоресцентных свойств. ^[22]

Маркировка белков

При маркировке белков используется короткая метка, чтобы минимизировать нарушение сворачивания и функционирования белка. Переходные металлы используются для связывания определенных остатков в метках с сайт-специфическими мишенями, такими как N-концы, C-концы или внутренние сайты внутри белка. Примеры меток, используемых для мечения белков, включают бимышьяковые метки, гистидиновые метки и метки FLAG. ^[1]

Генетическая маркировка

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) является примером метода генетического мечения, в котором используются зонды, специфичные для хромосомных участков по всей длине хромосомы, также известный как окраска хромосом . Несколько флуоресцентных красителей, каждый из которых имеет различную длину волны возбуждения и излучения, связываются с зондом, который затем гибридизуется с хромосомами. Флуоресцентный микроскоп может обнаружить присутствующие красители и отправить их на компьютер, который может определить кариотип клетки. Этот метод позволяет выявить такие аномалии, как делеции и дупликации. ^[24]

Визуализация клеток

Химические метки были адаптированы для технологий визуализации в большей степени, чем флуоресцентные белки, поскольку химические метки могут локализовать фотосенсибилизаторы ближе к целевым белкам. ^[25] Белки затем могут быть помечены и обнаружены с помощью визуализации, такой как микроскопия сверхвысокого разрешения , визуализация Ca ²⁺ , измерение pH, обнаружение перекиси водорода, инактивация хромофора светом и многофотонная световая микроскопия. Исследования визуализации in vivo на живых животных были проведены впервые с использованием мономерного белка, полученного из бактериальной галоалкандегалогеназы, известного как Halo-tag. ^{[22] [26]} Halo-tag ковалентно связывается со своим лигандом и обеспечивает лучшую экспрессию растворимых белков. ^[26]

Преимущества

Хотя флуоресцентные красители могут не обладать такой же чувствительностью, как радиоактивные зонды, они способны показывать активность молекул в действии в реальном времени. ^[27] Более того, радиация и соответствующее обращение больше не вызывают беспокойства.

С развитием флуоресцентного мечения флуоресцентная микроскопия позволила визуализировать специфические белки как на фиксированных, так и на живых изображениях клеток. Локализация специфических белков привела к появлению важных концепций клеточной биологии, таких как функции отдельных групп белков в клеточных мембранах и органеллах. При визуализации живых клеток флуоресцентные метки позволяют отслеживать движения белков и их взаимодействия. ^[24]

Последние достижения в методах использования флуоресцентных меток привели к визуализации мРНК и ее локализации в различных организмах. Визуализация РНК живых клеток может быть достигнута путем введения синтезированной РНК, химически связанной с флуоресцентной меткой, в живые клетки путем микроинъекции. Этот метод был использован, чтобы показать, как мРНК oskar у эмбриона дрозофилы локализуется в задней области ооцита . ^[17]

Смотрите также

• Молекулярная маркировка скорости
• Спектрофотометр для измерения нуклеиновых кислот
• Белковые теги

Примечания

1. Саху, Харекрушна (1 января 2012 г.). «Методы флуоресцентной маркировки биомолекул: воспоминания». РСК Прогресс . 2 (18): 7017–7029. Бибкод : 2012RSCAd...2.7017S. дои : 10.1039/C2RA20389H.
2. «Флуоресцентное мечение биомолекул органическими зондами - Презентации - PharmaXChange.info» . 29 января 2011 г.
3. Гвинн и Пейдж, Питер и Гай. «Тенденции в области лабораторных технологий: флуоресценция + маркировка». Наука . Проверено 10 марта 2013 г.
4. Kricka LJ, Fortina P (апрель 2009 г.). «Аналитическое происхождение: «первые» во флуоресцентном мечении нуклеозидов, нуклеотидов и нуклеиновых кислот». Клиническая химия . 55 (4): 670–83. дои : 10.1373/clinchem.2008.116152 . ПМИД  19233914.
5. Jing C, Cornish VW (сентябрь 2011 г.). «Химические метки для маркировки белков внутри живых клеток». Отчеты о химических исследованиях . 44 (9): 784–92. дои : 10.1021/ar200099f. ПМК 3232020 . ПМИД  21879706. 
6. «Зеленый флуоресцентный белок - История GFP - Осаму Шимомура» .
7. Симомура, Осаму. «Нобелевская премия по химии» . Проверено 5 апреля 2013 г.
8. Чен X, Смит Л.М., Брэдбери Э.М. (март 2000 г.). «Метка массовых участков стабильными изотопами в белках для точной и эффективной идентификации белков». Аналитическая химия . 72 (6): 1134–43. дои : 10.1021/ac9911600. ПМИД  10740850.
9. «Колориметрические анализы» . Проверено 3 апреля 2013 г.
10. Халеви, Ревитал; София Колушеваль; Роберт Э.В. Хэнкок; Раз Елинек (2002). «Колориметрические биосенсорные везикулы для биотехнологических применений» (PDF) . Материалы симпозиума Общества исследования материалов . 724. Биологические и биомиметические материалы. Функциональные свойства. Архивировано (PDF) из оригинала 14 октября 2013 г. Проверено 4 апреля 2013 г.
11. Люммер М., Хумперт Ф., Виденлюбберт М., Зауэр М., Шюттпельц М., Штайгер Д. (сентябрь 2013 г.). «Новый набор обратимо фотопереключаемых флуоресцентных белков для использования в трансгенных растениях». Молекулярный завод . 6 (5): 1518–30. дои : 10.1093/mp/sst040 . ПМИД  23434876.
12. Перье А., Морель Ф., Жакемен Д. (август 2012 г.). «Одномолекулярный мультифотохромизм с диарилэтенами». Отчеты о химических исследованиях . 45 (8): 1173–82. дои : 10.1021/ar200214k. ПМИД  22668009.
13. Чжан Ю, Ян Дж (январь 2013 г.). «Стратегии разработки флуоресцентных биоразлагаемых полимерных биоматериалов». Журнал химии материалов Б. 1 (2): 132–148. дои : 10.1039/C2TB00071G. ПМЦ 3660738 . ПМИД  23710326. 
14. "bioee.ee.columbia.edu" (PDF) . Архивировано из оригинала (PDF) 20 декабря 2012 г.
15. Кокс, Майкл; Нельсон, Дэвид Р.; Ленинджер, Альберт Л. (2008). Ленингерские принципы биохимии . Сан-Франциско: WH Freeman. ISBN 978-0-7167-7108-1.
16. Юнг Д., Мин К., Юнг Дж., Чан В., Квон Ю. (май 2013 г.). «Подходы к флуоресцентному мечению белков в живых клетках, основанные на химико-биологическом подходе». Молекулярные биосистемы . 9 (5): 862–72. дои : 10.1039/c2mb25422k. ПМИД  23318293.
17. Вейл Т.Т., Партон Р.М., Дэвис I (июль 2010 г.). «Делаем сообщение ясным: визуализация локализации мРНК». Тенденции в клеточной биологии . 20 (7): 380–90. дои : 10.1016/j.tcb.2010.03.006. ПМК 2902723 . ПМИД  20444605. 
18. Сент-Дьёрдьи С, Шмидт Б.Ф., Шмидт Б.А., Кригер Ю., Фишер Г.В., Закел К.Л., Адлер С., Фицпатрик Дж.А., Вулфорд Калифорния, Ян К., Васильев К.В., Бергет П.Б., Брюшес М.П., ​​Ярвик Дж.В., Вагонер А. (февраль 2008 г.) ). «Одноцепочечные антитела, активирующие флуороген, для визуализации белков клеточной поверхности». Природная биотехнология (Реферат). 26 (2): 235–40. дои : 10.1038/nbt1368. PMID  18157118. S2CID  21815631. Здесь мы сообщаем о разработке белков-репортеров, которые генерируют флуоресценцию из темных молекул (флуорогенов).
19. Пламон М.А., Бийон-Дени Э., Морен С., Гаурон С., Пимента Ф.М., Шпехт К.Г., Ши Дж., Керар Дж., Пан Б., Россиньоль Дж., Монкок К., Морелле Н., Волович М., Лескоп Е., Чен Ю., Триллер А. , Вриз С., Ле Со Т., Жюльен Л., Готье А. (январь 2016 г.). «Маленькая метка, активирующая флуоресценцию и сдвигающая поглощение, для настраиваемой визуализации белков in vivo». Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 113 (3): 497–502. Бибкод : 2016PNAS..113..497P. дои : 10.1073/pnas.1513094113 . ПМЦ 4725535 . ПМИД  26711992. 
20. Пейдж Дж.С., Ву К.Ю., Джеффри С.Р. (июль 2011 г.). «РНК имитирует зеленый флуоресцентный белок». Наука . 333 (6042): 642–6. Бибкод : 2011Sci...333..642P. дои : 10.1126/science.1207339. ПМЦ 3314379 . ПМИД  21798953. 
21. Рихтер А., Швагер С., Хентце С., Ансорж В., Хентце М.В., Мукенталер М. (сентябрь 2002 г.). «Сравнение методов маркировки ДНК флуоресцентными метками, используемых для анализа экспрессии с помощью микрочипов ДНК» (PDF) . БиоТехники . 33 (3): 620–8, 630. doi : 10.2144/02333rr05 . ПМИД  12238772.
22. Wombacher R, Cornish VW (июнь 2011 г.). «Химические метки: применение в флуоресцентной визуализации живых клеток». Журнал биофотоники . 4 (6): 391–402. дои : 10.1002/jbio.201100018 . ПМИД  21567974.
23. Юнг Д., Мин К., Юнг Дж., Чан В., Квон Ю. (май 2013 г.). «Подходы к флуоресцентному мечению белков в живых клетках, основанные на химико-биологическом подходе». Молекулярные биосистемы . 9 (5): 862–72. дои : 10.1039/C2MB25422K. ПМИД  23318293.
24. Мэтью П. Скотт; Лодиш, Харви Ф.; Арнольд Берк; Кайзер, Крис; Монти Кригер; Энтони Бретчер; Хидде Плуг; Анжелика Амон (2012). Молекулярно-клеточная биология . Сан-Франциско: WH Freeman. ISBN 978-1-4292-3413-9.
25. Эттингер, А (2014). «Флуоресцентная визуализация живых клеток». Методы клеточной биологии . 123 : 77–94. дои : 10.1016/B978-0-12-420138-5.00005-7. ISBN 9780124201385. ПМЦ  4198327 . ПМИД  24974023.
26. Н. Петерсон С., Квон К. (2012). «HaloTag: улучшение экспрессии растворимых веществ и их применение в функциональном анализе белков». Современная химическая геномика . 6 (1): 8–17. дои : 10.2174/1875397301206010008. ПМК 3480702 . ПМИД  23115610. 
27. Прудников Д, Мирзабеков А (ноябрь 1996 г.). «Химические методы флуоресцентного мечения ДНК и РНК». Исследования нуклеиновых кислот . 24 (22): 4535–42. дои : 10.1093/нар/24.22.4535. ПМК 146275 . ПМИД  8948646. 

Внешние ссылки