В световой микроскопии масляная иммерсия представляет собой метод, используемый для увеличения разрешающей способности микроскопа . Это достигается путем погружения объектива и образца в прозрачное масло с высоким показателем преломления , тем самым увеличивая числовую апертуру объектива.
Без масла световые волны отражаются от предметного стекла через покровное стекло, через воздух и в линзу микроскопа (см. цветной рисунок справа). Если волна не выходит под углом 90 градусов, она изгибается при столкновении с новым веществом, причем величина изгиба зависит от угла. Это искажает изображение. У воздуха совсем другой показатель преломления, чем у стекла, что приводит к большему изгибу по сравнению с маслом, показатель преломления которого более похож на показатель стекла. Специально изготовленное масло может иметь почти такой же показатель преломления, что и стекло, что делает линзу, погруженную в масло, почти такой же эффективной, как если бы образец был полностью стеклянным (что было бы непрактично).
Иммерсионные масла – это прозрачные масла, обладающие определенными оптическими и вязкостными характеристиками, необходимыми для использования в микроскопии. Типичные используемые масла имеют показатель преломления около 1,515. [1] Объектив с масляной иммерсией — это объектив, специально разработанный для такого использования. Многие конденсоры также обеспечивают оптимальное разрешение, когда конденсорная линза погружена в масло.
Линзы реконструируют свет, рассеянный объектом. В идеале для успешного достижения этой цели необходимо собрать все порядки дифракции. Это связано с углом раскрытия линзы и ее показателем преломления. Разрешение микроскопа определяется как минимальное расстояние, необходимое между двумя исследуемыми объектами, чтобы микроскоп мог различить их как отдельные объекты. Это минимальное расстояние обозначается δ. Если два объекта разделены расстоянием меньшим, чем δ, в микроскопе они предстанут как один объект.
Мера разрешающей способности линзы RP определяется ее числовой апертурой NA:
где λ — длина волны света. Отсюда ясно, что хорошее разрешение (малое δ) связано с высокой числовой апертурой.
Числовая апертура линзы определяется как
где α 0 — половина угла, охватываемого линзой объектива, видимого со стороны образца, а n — показатель преломления среды между линзой и образцом (≈1 для воздуха).
Современные объективы могут иметь числовую апертуру до 0,95. Поскольку sin α 0 всегда меньше или равен единице (число «1»), числовая апертура никогда не может быть больше единицы для объектива, находящегося в воздухе. Однако если пространство между линзой объектива и образцом заполнено маслом, числовая апертура может получить значения, превышающие единицу. Это потому, что масло имеет показатель преломления больше 1.
Из вышеизложенного понятно, что масло между образцом и линзой объектива улучшает разрешающую способность в 1/ n раз . Объективы, специально разработанные для этой цели, известны как объективы с масляной иммерсией.
Масляно-иммерсионные объективы используются только при очень больших увеличениях, требующих высокой разрешающей способности. Объективы с большим увеличением имеют короткие фокусные расстояния , что облегчает использование масла. На образец наносят масло (обычный микроскоп), а предметный столик поднимают, погружая объектив в масло. (В инвертированных микроскопах объектив наносится маслом).
Показатели преломления масла и стекла в первом элементе линзы почти одинаковы, а это означает, что преломление света при попадании в линзу будет небольшим (масло и стекло оптически очень похожи). Чтобы обеспечить точное совпадение показателей преломления, необходимо использовать подходящее иммерсионное масло для объектива . Использование масляно-иммерсионной линзы с неподходящим иммерсионным маслом или вообще без иммерсионного масла приведет к сферической аберрации. Сила этого эффекта зависит от величины рассогласования показателей преломления.
Масляную иммерсию обычно можно использовать только для жестко закрепленных образцов, в противном случае поверхностное натяжение масла может сдвинуть покровное стекло и, таким образом, сдвинуть образец под ним. Это также может произойти на инвертированных микроскопах, поскольку покровное стекло находится под предметным стеклом.
До разработки синтетических иммерсионных масел в 1940-х годах широко использовалось масло кедрового дерева . Кедровое масло имеет показатель преломления примерно 1,516. Числовая апертура объективов с маслом кедрового дерева обычно составляет около 1,3. Однако кедровое масло имеет ряд недостатков: оно поглощает синий и ультрафиолетовый свет, желтеет с возрастом, имеет достаточную кислотность, чтобы потенциально повредить объективы при многократном использовании (повреждая цемент, используемый для соединения линз ), а разбавление его растворителем меняет его вязкость ( и показатель преломления и дисперсия ). Кедровое масло необходимо удалить с объектива сразу после использования, пока оно не затвердело, поскольку удаление затвердевшего кедрового масла может повредить линзу. [2]
В современной микроскопии чаще используются синтетические иммерсионные масла, поскольку они устраняют большинство этих проблем. [2] Значения NA 1,6 могут быть достигнуты с использованием различных масел. В отличие от натуральных масел, синтетические не затвердевают на линзе и обычно могут оставаться на объективе в течение нескольких месяцев, хотя для лучшего обслуживания микроскопа лучше удалять масло ежедневно. Со временем масло может попасть в переднюю линзу объектива или в корпус объектива и повредить объектив. Существуют разные типы иммерсионных масел с разными свойствами в зависимости от типа микроскопии, которую вы будете выполнять. Тип A и тип B — это иммерсионные масла общего назначения с разной вязкостью. Иммерсионное масло типа F лучше всего использовать для флуоресцентной визуализации при комнатной температуре (23 °C), тогда как масло типа N предназначено для использования при температуре тела (37 °C) для визуализации живых клеток. Все они имеют D 1,515, что очень похоже на оригинальное кедровое масло. [3]
