Микроскоп 4Pi представляет собой лазерный сканирующий флуоресцентный микроскоп с улучшенным осевым разрешением . С его помощью типичный диапазон осевого разрешения 500–700 нм может быть улучшен до 100–150 нм, что соответствует почти сферическому фокусному пятну с объемом в 5–7 раз меньшим, чем у стандартной конфокальной микроскопии . [1]
Улучшение разрешения достигается за счет использования двух противоположных объективных линз, которые обе сфокусированы на одном и том же геометрическом месте. Кроме того, разница в оптической длине пути через каждую из двух объективных линз тщательно выравнивается, чтобы быть минимальной. С помощью этого метода молекулы, находящиеся в общей фокальной области обоих объективов, могут быть освещены когерентно с обеих сторон, а отраженный или излучаемый свет также может быть собран когерентно, т. е. возможна когерентная суперпозиция излучаемого света на детекторе. Телесный угол , который используется для освещения и обнаружения, увеличивается и приближается к своему максимуму. В этом случае образец освещается и обнаруживается со всех сторон одновременно.
Режим работы микроскопа 4Pi показан на рисунке. Лазерный свет разделяется светоделителем и направляется зеркалами к двум противоположным объективным линзам. В общей фокальной точке происходит суперпозиция обоих сфокусированных световых пучков. Возбужденные молекулы в этой точке испускают флуоресцентный свет, который собирается обеими объективными линзами, объединяется тем же светоделителем и отклоняется дихроичным зеркалом на детектор. Там может снова произойти суперпозиция обоих испускаемых световых путей.
В идеальном случае каждая объективная линза может собирать свет с телесного угла . С двумя объективными линзами можно собирать свет с каждого направления (телесный угол ). Название этого типа микроскопии происходит от максимально возможного телесного угла для возбуждения и обнаружения. На практике можно достичь только углов апертуры около 140° для объективной линзы, что соответствует .
Микроскоп может работать тремя различными способами: В микроскопе 4Pi типа A когерентная суперпозиция возбуждающего света используется для создания повышенного разрешения. Испускаемый свет либо обнаруживается только с одной стороны, либо в некогерентной суперпозиции с обеих сторон. В микроскопе 4Pi типа B интерферирует только испускаемый свет. При работе в режиме типа C интерферируют как возбуждающий, так и испускаемый свет, что приводит к максимально возможному увеличению разрешения (~7 раз вдоль оптической оси по сравнению с конфокальной микроскопией).
В реальном микроскопе 4Pi свет не может быть применен или собран со всех направлений одинаково, что приводит к так называемым боковым лепесткам в функции рассеяния точки . Обычно (но не всегда) в микроскопе 4Pi используется микроскопия с двухфотонным возбуждением в сочетании с эмиссионной точечной диафрагмой для снижения этих боковых лепестков до приемлемого уровня.
В 1971 году Кристоф Кремер и Томас Кремер предложили создать идеальную голограмму , то есть такую, которая несет в себе всю полевую информацию об излучении точечного источника во всех направлениях, так называемую голограмму. [2] [3] Однако публикация 1978 года [4] сделала неправильный физический вывод (то есть точечное пятно света) и полностью упустила из виду увеличение осевого разрешения как фактическое преимущество добавления другой стороны телесного угла. [5] Первое описание практической системы микроскопии 4Pi, то есть установки с двумя противостоящими интерферирующими линзами, было изобретено Стефаном Хеллом в 1991 году . [6] Он продемонстрировал это экспериментально в 1994 году. [7]
В последующие годы число приложений для этого микроскопа возросло. Например, параллельное возбуждение и детектирование с 64 точками в образце одновременно в сочетании с улучшенным пространственным разрешением привели к успешной регистрации динамики митохондрий в дрожжевых клетках с помощью микроскопа 4Pi в 2002 году. [8] Коммерческая версия была запущена производителем микроскопов Leica Microsystems в 2004 году [9] и позже снята с производства.
До сих пор наилучшее качество в микроскопе 4Pi достигалось в сочетании с методами сверхвысокого разрешения, такими как принцип истощения стимулированного излучения (STED). [10] Используя микроскоп 4Pi с соответствующими возбуждающими и девозбуждающими лучами, можно было создать равномерное пятно размером 50 нм, что соответствует уменьшенному фокусному объему по сравнению с конфокальной микроскопией в 150–200 раз в фиксированных клетках. Благодаря сочетанию микроскопии 4Pi и микроскопии RESOLFT с переключаемыми белками теперь можно делать изображения живых клеток при низких уровнях освещенности с изотропным разрешением ниже 40 нм. [11]
