Микроскоп 4Pi — это лазерный сканирующий флуоресцентный микроскоп с улучшенным осевым разрешением . С его помощью типичный диапазон осевого разрешения 500–700 нм может быть улучшен до 100–150 нм, что соответствует почти сферическому фокальному пятну с объемом в 5–7 раз меньшим, чем у стандартной конфокальной микроскопии . [1]
Улучшение разрешения достигается за счет использования двух противоположных объективов, которые фокусируются в одном и том же геометрическом положении. Кроме того, разница в длине оптического пути через каждую из двух линз объектива тщательно выровнена, чтобы быть минимальной. С помощью этого метода молекулы, находящиеся в общей фокальной области обоих объективов, могут быть когерентно освещены с обеих сторон, а отраженный или испускаемый свет также может быть когерентно собран, т.е. возможна когерентная суперпозиция излучаемого света на детекторе. Телесный угол , используемый для освещения и обнаружения, увеличивается и приближается к максимальному. В этом случае образец освещается и детектируется со всех сторон одновременно.
Режим работы микроскопа 4Пи показан на рисунке. Лазерный свет разделяется светоделителем и направляется зеркалами на две противоположные линзы объектива. В общей фокусной точке происходит суперпозиция обоих сфокусированных световых лучей. Возбужденные молекулы в этом положении излучают флуоресцентный свет, который собирается обеими линзами объектива, объединяется одним и тем же светоделителем и отклоняется дихроичным зеркалом на детектор. Снова может произойти суперпозиция обоих путей испускания света.
В идеальном случае каждая линза объектива может собирать свет под телесным углом . С помощью двух объективов можно собирать данные со всех направлений (телесный угол ). Название этого типа микроскопии происходит от максимально возможного телесного угла возбуждения и обнаружения. Практически для объектива можно добиться лишь апертурных углов около 140°, что соответствует .
Микроскопом можно управлять тремя различными способами: В микроскопе 4Pi типа A для создания повышенного разрешения используется когерентная суперпозиция возбуждающего света. Свет излучения регистрируется либо только с одной стороны, либо в виде некогерентной суперпозиции с обеих сторон. В микроскопе 4Pi типа B интерферирует только световое излучение. При работе в режиме типа C допускается интерференция как возбуждающего, так и испускаемого света, что приводит к максимально возможному увеличению разрешения (~ 7 раз вдоль оптической оси по сравнению с конфокальной микроскопией).
В реальном микроскопе 4Pi свет не может быть приложен или собран со всех направлений одинаково, что приводит к так называемым боковым лепесткам в функции рассеяния точки . Обычно (но не всегда) микроскопия с двухфотонным возбуждением используется в микроскопе 4Pi в сочетании с эмиссионным отверстием для снижения этих боковых лепестков до приемлемого уровня.
В 1971 году Кристоф Кремер и Томас Кремер предложили создать идеальную голограмму , то есть такую, которая несет всю информацию о поле излучения точечного источника во всех направлениях, так называемую голограмму. [2] [3] Однако в публикации 1978 года [4] был сделан неправильный физический вывод (т.е. точечное пятно света) и полностью упущено увеличение осевого разрешения как фактическое преимущество добавления другой стороны твердого тела. угол. [5] Первое описание практической системы 4Pi-микроскопии, то есть установки с двумя противоположными интерферирующими линзами, было изобретено Стефаном Хеллом в 1991 году. [6] Он продемонстрировал ее экспериментально в 1994 году. [7]
В последующие годы число применений этого микроскопа выросло. Например, параллельное возбуждение и детектирование с помощью 64 пятен в образце одновременно в сочетании с улучшенным пространственным разрешением привело к успешной регистрации динамики митохондрий в дрожжевых клетках с помощью микроскопа 4Pi в 2002 году. [8] Была запущена коммерческая версия микроскопа. производителем Leica Microsystems в 2004 году [9] и позже снято с производства.
До сих пор наилучшее качество в микроскопе 4Pi достигалось в сочетании с методами сверхразрешения, такими как принцип истощения стимулированного излучения (STED). [10] Используя микроскоп 4Pi с соответствующими лучами возбуждения и девозбуждения, удалось создать пятно однородного размера 50 нм, что соответствует уменьшению фокального объема по сравнению с конфокальной микроскопией в 150–200 раз в фиксированных клетках. Благодаря сочетанию микроскопии 4Pi и микроскопии RESOLFT с переключаемыми белками теперь можно получать изображения живых клеток при низких уровнях освещенности с изотропным разрешением ниже 40 нм. [11]
