Микротом ( от греческого mikros , что означает «маленький», и temnein , что означает «разрезать») — это режущий инструмент , используемый для изготовления чрезвычайно тонких срезов материала, известных как срезы , причем этот процесс называется микросрезами . Важное значение для науки : микротомы используются в микроскопии для подготовки образцов для наблюдения в проходящем свете или электронном излучении.
В микротомах используются стальные , стеклянные или алмазные лезвия в зависимости от нарезаемого образца и желаемой толщины разрезаемых срезов. Стальные лезвия используются для подготовки гистологических срезов тканей животных и растений для световой микроскопии . Стеклянные ножи используются для нарезки срезов для световой микроскопии и для нарезки очень тонких срезов для электронной микроскопии . Алмазные ножи промышленного класса используются для нарезки твердых материалов, таких как кости , зубы и твердые растительные вещества, как для световой, так и для электронной микроскопии. Алмазные ножи ювелирного качества также используются для нарезки тонких срезов для электронной микроскопии.
Микротомия — это метод подготовки тонких срезов таких материалов, как кости, минералы и зубы, а также альтернатива электрополировке и ионному фрезерованию . Срезы микротома можно сделать достаточно тонкими, чтобы можно было разрезать человеческий волос по ширине, с толщиной среза от 50 нм до 100 мкм .
На заре развития светового микроскопа срезы растений и животных готовили вручную с помощью бритвенных лезвий. Было обнаружено, что для наблюдения за структурой наблюдаемого образца важно сделать чистые воспроизводимые разрезы порядка 100 мкм, через которые можно пропускать свет. Это позволило наблюдать образцы с помощью световых микроскопов в просвечивающем режиме.
Одно из первых приспособлений для приготовления таких отрубов было изобретено в 1770 году Джорджем Адамсом-младшим (1750–1795) и далее развито Александром Каммингсом . [2] Устройство управлялось вручную: образец удерживался в цилиндре, а секции создавались из верхней части образца с помощью ручной рукоятки. [1] [3]
В 1835 году Эндрю Причард разработал модель на основе стола, которая позволяла изолировать вибрацию, прикрепив устройство к столу, отделив оператора от ножа. [4]
Иногда приписывание изобретения микротома приписывают анатому Вильгельму Хису-старшему (1865 г.). [5] [6] В своей книге «Beschreibung eines Mikrotoms» (по-немецки « Описание микротома ») Вильгельм писал:
Аппарат обеспечил точность в работе, благодаря которой я могу достичь участков, которые я не могу создать вручную. А именно это позволило добиться возможности получения непрерывных участков объектов в ходе исследования.
Другие источники также приписывают разработку чешскому физиологу Яну Евангелисте Пуркине . [7] В нескольких источниках модель Пуркина описывается как первая в практическом использовании. [8] [9]
Неясность происхождения микротома связана с тем, что первые микротомы были просто режущими аппаратами, а фаза разработки ранних устройств практически не документирована.
В конце 1800-х годов создание очень тонких и постоянно тонких образцов с помощью микротомии вместе с избирательным окрашиванием важных клеточных компонентов или молекул позволило визуализировать детали микроскопа. [10] [11]
Сегодня большинство микротомов представляют собой ножевую конструкцию со сменным ножом, держателем образца и механизмом продвижения. В большинстве устройств резка образца начинается с перемещения образца над ножом, при этом механизм продвижения автоматически перемещается вперед, так что можно сделать следующий разрез выбранной толщины. Толщина секции контролируется механизмом регулировки, обеспечивающим точный контроль.
Наиболее распространенными применениями микротомов являются:
Последней разработкой является лазерный микротом , который разрезает целевой образец фемтосекундным лазером вместо механического ножа. Этот метод бесконтактный и не требует техники подготовки проб. Лазерный микротом способен разрезать практически любую ткань в ее естественном состоянии. В зависимости от обрабатываемого материала возможна толщина среза от 10 до 100 мкм.
Интервалы секционирования можно разделить главным образом на:
Санный микротом — это устройство, в котором образец помещается в фиксированный держатель (челнок), который затем перемещается вперед и назад по ножу. В современных микротомах салазки расположены на линейном подшипнике, конструкция которого позволяет микротому легко разрезать множество грубых срезов. [13] Регулируя углы между образцом и ножом микротома, можно уменьшить давление, оказываемое на образец во время разреза. [13] Типичным применением микротомов такой конструкции является подготовка крупных образцов, например, залитых в парафин для биологических препаратов. Типичная толщина среза, достижимая на санном микротоме, составляет от 1 до 60 мкм.
Этот инструмент представляет собой обычную конструкцию микротома. Это устройство работает с поэтапным вращательным действием, так что фактическое резание является частью вращательного движения. В ротационном микротоме нож обычно фиксируется в вертикальном положении. [14]
На рисунке слева поясняется принцип разреза. За счет движения держателя образца образец разрезается ножом из положения 1 в положение 2, после чего свежий срез остается на ноже. В высшей точке вращательного движения держатель образца выдвигается на ту же толщину, что и срез, который необходимо изготовить, позволяя изготовить следующий срез.
Маховик многих микротомов можно управлять вручную. Преимущество этого метода состоит в том, что можно выполнить чистый разрез, поскольку относительно большая масса маховика предотвращает остановку образца во время его разрезания. В новых моделях маховик часто встроен в корпус микротома. Типичная толщина среза ротационного микротома составляет от 1 до 60 мкм. Для твердых материалов, таких как образцы, залитые синтетической смолой, такая конструкция микротома позволяет получать хорошие «полутонкие» срезы толщиной всего 0,5 мкм.
Для резки замороженных образцов многие ротационные микротомы можно адаптировать для резки в камере с жидким азотом в так называемой криомикротомной установке. Пониженная температура позволяет повысить твердость образца, например, за счет стеклования, что позволяет готовить полутонкие образцы. [13] Однако температуру образца и температуру ножа необходимо контролировать, чтобы оптимизировать полученную толщину образца.
Ультрамикротом — основной инструмент ультрамикротомии . Он позволяет готовить очень тонкие срезы, при этом устройство работает так же, как ротационный микротом, но с очень жесткими допусками на механическую конструкцию. Благодаря тщательно продуманной механической конструкции линейное тепловое расширение крепления используется для обеспечения очень точного контроля толщины. [13]
Эти чрезвычайно тонкие срезы важны для использования с просвечивающим электронным микроскопом (ПЭМ) и серийной сканирующей электронной микроскопией (SBFSEM), а иногда также важны для светооптической микроскопии. [14] Типичная толщина этих срезов составляет от 40 до 100 нм для просвечивающей электронной микроскопии и часто от 30 до 50 нм для SBFSEM. Более толстые срезы толщиной до 500 нм также берутся для специализированных приложений TEM или для срезов для исследования с помощью световой микроскопии, чтобы выбрать область для окончательных тонких срезов. С ультрамикротомами используются алмазные ножи (предпочтительно) и стеклянные ножи. Чтобы собрать срезы, их помещают на поверхность жидкости во время разрезания и осторожно помещают на сетку, подходящую для просмотра образцов ПЭМ. Толщину среза можно оценить по цветам тонкопленочной интерференции отраженного света, которые видны из-за чрезвычайно малой толщины образца. [15]
Вибрирующий микротом работает путем резки с помощью вибрирующего лезвия, что позволяет производить разрез с меньшим давлением, чем требовалось бы для неподвижного лезвия. Вибрационный микротом обычно используется для сложных биологических образцов. [13] Толщина среза обычно составляет около 30–500 мкм для живой ткани и 10–500 мкм для фиксированной ткани. [16]
Разновидностью вибрирующего микротома является микротом Compresstome. [17] В Compresstome для удержания ткани используется шприц для образца или трубка, похожая на губную помаду. [18] Образец ткани полностью погружен в агарозу ( полисахарид ), и ткань медленно и осторожно выдавливается из пробирки для разрезания вибрирующим лезвием. Устройство работает следующим образом: конец пробирки для образца, из которого выходит ткань, немного уже, чем загрузочный конец, что обеспечивает мягкое «сжатие» ткани при ее выходе из пробирки. Небольшое сжатие предотвращает образование сдвигов, неравномерной резки и вибрации. Обратите внимание, что технология сжатия не повреждает и не влияет на разрезаемую ткань.
Микротом Compresstome имеет ряд преимуществ: 1) заделка в агарозу обеспечивает стабильность всего образца со всех сторон, что предотвращает неравномерность нарезки или разрезания ткани; 2) технология сжатия мягко сжимает ткань для равномерного разреза, так что лезвие не прижимается к ткани; 3) более быстрое получение срезов, чем у большинства вибрирующих микротомов; и 4) он хорошо разрезает ткани старых или более зрелых животных, обеспечивая более здоровые ткани. [19]
Пильный микротом специально предназначен для твердых материалов, таких как зубы или кости. Микротом этого типа имеет утопленную вращающуюся пилу, которая разрезает образец. Минимальная толщина среза составляет около 30 мкм и может быть выполнена для сравнительно больших образцов. [13]
Лазерный микротом – это инструмент для бесконтактного нарезки срезов . [20] Предварительная подготовка образца путем заливки, замораживания или химической фиксации не требуется, что сводит к минимуму артефакты, возникающие в результате методов подготовки. В качестве альтернативы эту конструкцию микротома можно также использовать для очень твердых материалов, таких как кости или зубы, а также некоторых видов керамики. В зависимости от свойств материала образца достижимая толщина составляет от 10 до 100 мкм.
Устройство работает за счет режущего действия инфракрасного лазера. Поскольку лазер излучает излучение в ближнем инфракрасном диапазоне, в этом режиме длины волны лазер может взаимодействовать с биологическими материалами. За счет четкой фокусировки зонда внутри образца можно добиться фокуса очень высокой интенсивности, до ТВт /см 2 . Благодаря нелинейному взаимодействию оптического проникновения в фокальной области происходит разделение материала в процессе, известном как фоторазрушение. Ограничивая длительность лазерного импульса фемтосекундным диапазоном, энергия, расходуемая в целевой области, точно контролируется, тем самым ограничивая зону взаимодействия разреза величиной менее микрометра. За пределами этой зоны время воздействия сверхкороткого луча приводит к минимальному термическому повреждению остальной части образца или к его полному отсутствию.
Лазерное излучение направляется на быстро сканирующую оптическую систему на основе зеркала, которая обеспечивает трехмерное позиционирование точки пересечения луча, одновременно обеспечивая перемещение луча в желаемую интересующую область. Сочетание высокой мощности и высокой скорости растра позволяет сканеру за короткое время вырезать большие площади образца. На лазерном микротоме также возможна лазерная микродиссекция внутренних участков тканей, клеточных структур и других мелких образований.
Выбор профиля лезвия ножа микротома зависит от материала и подготовки образцов, а также от окончательных требований к образцам (например, толщины и качества среза).
Как правило, ножи характеризуются профилем лезвия ножа, который подпадает под категории плоско-вогнутых, клиновидных или долотообразных конструкций.
Плоские вогнутые ножи микротома чрезвычайно острые, но при этом очень деликатные и поэтому используются только с очень мягкими образцами. [14] Ножи с клиновым профилем несколько более стабильны и находят применение при обработке материалов средней твердости, например, при резке эпоксидной смолы или криогенных образцов. Наконец, профиль долота с тупой кромкой повышает устойчивость ножа, но при этом для выполнения разреза требуется значительно большее усилие.
Для ультрамикротомов требуются стеклянные и алмазные ножи, поэтому ширина среза лезвия составляет порядка нескольких миллиметров и, следовательно, значительно меньше, чем у классических ножей для микротомов. Стеклянные ножи обычно изготавливаются путем разрушения стеклянных брусков с использованием специальных устройств для разрушения «ножевиков». Стеклянные ножи можно использовать для первоначальной подготовки проб, даже если для окончательного разрезания можно использовать алмазные ножи. Стеклянные ножи обычно имеют небольшие желоба, сделанные из пластиковой ленты, которые заполняются водой, чтобы образец мог плавать для последующего сбора. [13] В такой существующий желоб можно встроить алмазные лезвия, что позволит использовать тот же метод сбора.
Перед разрезанием на микротоме биологические материалы обычно помещают в более жесткий фиксатор в процессе, известном как заливка. Это достигается за счет притока жидкого вещества вокруг образца, такого как парафин (воск) или эпоксидная смола, которое помещается в форму и позже затвердевает, образуя «блок», который легко разрезать.
Склонение представляет собой угол контакта между вертикалью образца и лезвием ножа. Если лезвие ножа расположено под прямым углом (наклон = 90), рез производится непосредственно с использованием режима давления, и поэтому силы пропорционально больше. Однако если нож наклонен, относительное движение ножа становится все более параллельным движению образца, что позволяет осуществлять разрезание. Такое поведение очень важно для больших или твердых образцов.
Наклон ножа — это угол между торцом ножа и образцом. Для оптимального результата этот угол должен быть выбран соответствующим образом. Оптимальный угол зависит от геометрии ножа, скорости резания и многих других параметров. Если угол отрегулирован на ноль, рез ножа часто может стать неравномерным, и для сглаживания этого необходимо использовать новое положение ножа.
Если угол слишком велик, образец может смяться, а нож может вызвать периодические изменения толщины среза. Дальнейшее увеличение угла настолько, что он станет слишком большим, может привести к повреждению самого лезвия ножа.
Многие компании производят микротомы для коммерческих целей.
Ротационные микротомы широко используются в лабораториях и гистологии для точного разделения биологических образцов. Лишь немногие производители получили признание за производство ротационных микротомов.
