.jpg/1280px-Two_percent_Agarose_Gel_in_Borate_Buffer_cast_in_a_Gel_Tray_(Front,_angled).jpg)
Агароза — это гетерополисахарид , обычно извлекаемый из некоторых красных водорослей . [1] Это линейный полимер, состоящий из повторяющейся единицы агаробиозы, которая является дисахаридом, состоящим из D -галактозы и 3,6-ангидро- L -галактопиранозы. [2] [3] Агароза — один из двух основных компонентов агара , и очищается от агара путем удаления другого компонента агара, агаропектина . [4]
Агароза часто используется в молекулярной биологии для разделения больших молекул, особенно ДНК , с помощью электрофореза . Пластины агарозного геля (обычно 0,7 - 2%) для электрофореза легко готовятся путем заливки теплого жидкого раствора в форму. Для этой цели в продаже имеется широкий спектр различных агароз с различной молекулярной массой и свойствами. Агарозу также можно формировать в шарики и использовать в ряде хроматографических методов очистки белков .
Агароза представляет собой линейный полимер с молекулярной массой около 120 000, состоящий из чередующихся D - галактозы и 3,6-ангидро -L -галактопиранозы, связанных α-(1→3) и β-(1→4) гликозидными связями. 3,6-ангидро- L -галактопираноза представляет собой L -галактозу с ангидромостиком между позициями 3 и 6, хотя некоторые единицы L -галактозы в полимере могут не содержать мостика. Некоторые единицы D -галактозы и L -галактозы могут быть метилированы , а пируват и сульфат также встречаются в небольших количествах. [5]
Каждая цепочка агарозы содержит ~800 молекул галактозы, а цепи полимера агарозы образуют спиральные волокна, которые объединяются в суперспиральную структуру с радиусом 20-30 нанометров (нм). [6] Волокна являются квазижесткими и имеют широкий диапазон длины в зависимости от концентрации агарозы. [7] При затвердевании волокна образуют трехмерную сетку каналов диаметром от 50 нм до >200 нм в зависимости от концентрации используемой агарозы - более высокие концентрации дают более низкие средние диаметры пор. Трехмерная структура удерживается вместе водородными связями и, следовательно, может быть разрушена при нагревании обратно до жидкого состояния.
Агароза доступна в виде белого порошка, который растворяется в почти кипящей воде и образует гель при охлаждении. Агароза демонстрирует явление термического гистерезиса при переходе из жидкого состояния в гель, т. е. она гелеобразуется и плавится при разных температурах. Температуры гелеобразования и плавления различаются в зависимости от типа агарозы. Стандартные агарозы, полученные из Gelidium, имеют температуру гелеобразования 34–38 °C (93–100 °F) и температуру плавления 90–95 °C (194–203 °F), в то время как полученные из Gracilaria , из-за ее более высоких метоксизаместителей , имеют температуру гелеобразования 40–52 °C (104–126 °F) и температуру плавления 85–90 °C (185–194 °F). [8] Температуры плавления и гелеобразования могут зависеть от концентрации геля, особенно при низкой концентрации геля менее 1%. Поэтому температуры гелеобразования и плавления указаны при определенной концентрации агарозы.
Натуральная агароза содержит незаряженные метильные группы, а степень метилирования прямо пропорциональна температуре гелеобразования. Синтетическое метилирование, однако, имеет обратный эффект, при котором повышенное метилирование снижает температуру гелеобразования. [9] Разнообразие химически модифицированных агароз с различными температурами плавления и гелеобразования доступно посредством химических модификаций.
Агароза в геле образует сетку, содержащую поры, а размер пор зависит от концентрации добавленной агарозы. При стоянии агарозные гели склонны к синерезису (выдавливанию воды через поверхность геля), но этот процесс достаточно медленный, чтобы не мешать использованию геля. [10] [11]
Агарозный гель может иметь высокую прочность геля при низкой концентрации, что делает его подходящим в качестве антиконвекционной среды для гель-электрофореза . Агарозные гели, разбавленные до 0,15%, могут образовывать пластины для гель-электрофореза. [12] Полимер агарозы содержит заряженные группы, в частности пируват и сульфат . [9] Эти отрицательно заряженные группы могут замедлять движение молекул ДНК в процессе, называемом электроэндосмосом (EEO).
Поэтому агароза с низким EEO (LE) обычно предпочтительна для использования в электрофорезе нуклеиновых кислот в агарозном геле . Также доступны агарозы с нулевым EEO, но они могут быть нежелательны для некоторых применений, поскольку они могут быть получены путем добавления положительно заряженных групп, которые могут повлиять на последующие ферментативные реакции. [13] Электроэндосмос является причиной того, что агарозу используют предпочтительно, а не агар, поскольку агаропектин в агаре содержит значительное количество отрицательно заряженных сульфатных и карбоксильных групп. Удаление агаропектина из агарозы существенно снижает EEO, а также снижает неспецифическую адсорбцию биомолекул в матрице геля. Однако для некоторых применений, таких как электрофорез сывороточного белка, может быть желателен высокий EEO, и агаропектин может быть добавлен в используемый гель. [14]
Говорят, что агароза LE лучше подходит для препаративного электрофореза, то есть когда ДНК необходимо извлечь из агарозного геля. [15]
Температуры плавления и гелеобразования агарозы можно изменять с помощью химических модификаций, чаще всего с помощью гидроксиэтилирования, что приводит к снижению количества внутрицепочечных водородных связей, что приводит к более низким температурам плавления и застывания по сравнению со стандартными агарозами. [16] Точная температура определяется степенью замещения, и многие доступные агарозы с низкой температурой плавления (LMP) могут оставаться жидкими в диапазоне 30–35 °C (86–95 °F). Это свойство позволяет проводить ферментативные манипуляции непосредственно после электрофореза ДНК в геле путем добавления кусочков расплавленного геля, содержащего интересующий фрагмент ДНК, в реакционную смесь. Агароза LMP содержит меньше сульфатов, которые могут влиять на некоторые ферментативные реакции, и поэтому предпочтительно используется для некоторых применений.
Гидроксиэтилированная агароза также имеет меньший размер пор (~90 нм), чем стандартные агарозы. [17] Гидроксиэтилирование может уменьшить размер пор за счет снижения плотности упаковки пучков агарозы, поэтому гель LMP также может оказывать влияние на время и разделение во время электрофореза. [18] Агарозы со сверхнизкой температурой плавления или гелеобразования могут образовывать гель только при температуре 8–15 °C (46–59 °F).
Агароза является предпочтительной матрицей для работы с белками и нуклеиновыми кислотами , поскольку она имеет широкий спектр физической, химической и термической стабильности, а ее более низкая степень химической сложности также делает ее менее вероятной для взаимодействия с биомолекулами . Агароза чаще всего используется в качестве среды для аналитического масштабного электрофоретического разделения в электрофорезе в агарозном геле . Гели, изготовленные из очищенной агарозы, имеют относительно большой размер пор, что делает их полезными для разделения больших молекул, таких как белки и белковые комплексы >200 килодальтон, а также фрагменты ДНК >100 пар оснований. Агароза также широко используется для ряда других применений, например, иммунодиффузии и иммуноэлектрофореза , поскольку агарозные волокна могут функционировать как якорь для иммунокомплексов .
Электрофорез в агарозном геле является рутинным методом разделения ДНК в лаборатории. Агарозные гели имеют более низкую разрешающую способность для ДНК, чем акриламидные гели, но они имеют больший диапазон разделения и поэтому обычно используются для фрагментов ДНК длиной 50–20 000 п.н. ( пар оснований ), хотя разрешение более 6 Мб возможно с помощью электрофореза в пульсирующем поле (PFGE). [19] Его также можно использовать для разделения больших молекул белка, и он является предпочтительной матрицей для гель-электрофореза частиц с эффективным радиусом более 5–10 нм. [12]
Размер пор геля влияет на размер ДНК, которую можно просеять. Чем ниже концентрация геля, тем больше размер пор и тем больше ДНК, которую можно просеять. Однако гели с низкой концентрацией (0,1–0,2%) хрупкие и поэтому с ними трудно работать, а электрофорез больших молекул ДНК может занять несколько дней. Предел разрешения для стандартного электрофореза в агарозном геле составляет около 750 кб. [19] Этот предел можно преодолеть с помощью PFGE, где к гелю прикладываются чередующиеся ортогональные электрические поля. Фрагменты ДНК переориентируются, когда приложенное поле меняет направление, но более крупным молекулам ДНК требуется больше времени, чтобы перестроиться, когда электрическое поле изменяется, в то время как для более мелких это происходит быстрее, и поэтому ДНК можно фракционировать в соответствии с размером.
Агарозные гели отливаются в форму и после застывания обычно погружаются горизонтально в буферный раствор. Обычно используются буферы трис-ацетат-ЭДТА и трис-борат-ЭДТА , но в других приложениях могут использоваться и другие буферы, такие как трис-фосфат, барбитуровая кислота-барбитурат натрия или трис- барбитурат . [1] ДНК обычно визуализируется путем окрашивания бромистым этидием , а затем просматривается под УФ-светом , но доступны и другие методы окрашивания, такие как SYBR Green , GelRed , метиленовый синий и кристаллический фиолетовый . Если разделенные фрагменты ДНК необходимы для дальнейшего эксперимента, их можно вырезать из геля на срезы для дальнейшей обработки.
Матрица агарозного геля часто используется для очистки белка , например, в препаративном разделении на основе колонок, как в гель-фильтрационной хроматографии , аффинной хроматографии и ионообменной хроматографии . Однако он не используется в качестве непрерывного геля, а формируется в пористые шарики или смолы различной тонкости. [20] Шарики очень пористые, поэтому белок может свободно протекать через шарики. Эти шарики на основе агарозы, как правило, мягкие и легко измельчаются, поэтому их следует использовать в условиях гравитационного потока, низкоскоростного центрифугирования или процедур низкого давления. [21] Прочность смол может быть улучшена за счет увеличения сшивания и химического упрочнения агарозных смол, однако такие изменения могут также привести к более низкой связывающей способности для белка в некоторых процедурах разделения, таких как аффинная хроматография .
Агароза является полезным материалом для хроматографии, поскольку она не поглощает биомолекулы в значительной степени, имеет хорошие свойства текучести и может выдерживать экстремальные значения pH и ионной силы , а также высокую концентрацию денатурирующих агентов , таких как 8M мочевина или 6M гуанидин HCl . [22] Примерами матриц на основе агарозы для гель-фильтрационной хроматографии являются Sepharose и WorkBeads 40 SEC (сшитая агароза с шариками), Praesto и Superose (высокосшитая агароза с шариками) и Superdex ( декстран, ковалентно связанный с агарозой).
Для аффинной хроматографии наиболее часто используемой матричной смолой для прикрепления лигандов, связывающих белок, является агарозный бисер. [23] Лиганды ковалентно связаны через спейсер с активированными гидроксильными группами полимера агарозного бисерного материала. Затем интересующие белки можно селективно связать с лигандами, чтобы отделить их от других белков, после чего их можно элюировать. Используемые агарозные бисеринки обычно имеют плотность 4% и 6% с высокой связывающей способностью для белка.
Агарозная пластина иногда может использоваться вместо агара для культивирования организмов, поскольку агар может содержать примеси, которые могут повлиять на рост организма или некоторые последующие процедуры, такие как полимеразная цепная реакция (ПЦР). Агароза также тверже агара и поэтому может быть предпочтительнее там, где необходима большая прочность геля, а ее более низкая температура гелеобразования может предотвратить возникновение теплового шока у организма, когда клетки суспендируются в жидкости перед гелеобразованием. Ее можно использовать для культивирования строгих автотрофных бактерий, протопластов растений , [24] Caenorhabditis elegans , [25] других организмов и различных клеточных линий.
Иногда вместо агара используют агарозу для измерения подвижности и мобильности микроорганизмов. Подвижные виды смогут мигрировать, хотя и медленно, по всему пористому гелю, и тогда можно будет визуализировать скорость инфильтрации. Пористость геля напрямую связана с концентрацией агара или агарозы в среде, поэтому для оценки плавания , роения , скольжения и подергивания клеток можно использовать гели с различной концентрацией. Анализ миграции клеток под агарозой можно использовать для измерения хемотаксиса и хемокинеза. Слой агарозного геля помещают между популяцией клеток и хемоаттрактантом . Поскольку градиент концентрации развивается из-за диффузии хемоаттрактанта в гель, различные популяции клеток, требующие различных уровней стимуляции для миграции, затем можно визуализировать с течением времени с помощью микрофотографии, поскольку они туннелируют вверх через гель против силы тяжести вдоль градиента.