stringtranslate.com

SDD-ВОЗРАСТ

Пример полученного вестерн-блоттинга после электрофоретического разделения SDD-AGE, окрашивания специфическими антителами.

В биохимии и молекулярной биологии SDD - AGE — это сокращение от полуденатурирующего детергента Агарозный гель - электрофорез . Это метод обнаружения и характеристики крупных белковых полимеров , которые стабильны в 2% SDS при комнатной температуре , в отличие от большинства крупных белковых комплексов . Этот метод очень полезен для изучения прионов и амилоидов , для которых характерно образование белковых полимеров. [1] [2] [3] [4] [5] [6] Для геля используется агароза, поскольку устойчивые к SDS полимеры имеют большие размеры (в диапазоне 200-4000+ кДа) и не могут проникнуть в обычный полиакриламидный гель . который имеет мелкие поры. С другой стороны, агароза имеет большие поры, что позволяет разделять полимеры.

Использование этого метода позволило исследователям понять, что по крайней мере некоторые типы прионных агрегатов существуют в двухуровневой структуре - белковые молекулы , сгруппированные в полимеры, которые очень стабильны и выдерживают обработку 2% SDS при комнатной температуре, и агрегаты, которые пучки полимеров, которые диссоциируют в этих условиях.

Различия в размерах полимеров могут указывать на эффективность фрагментации полимеров in vivo .

История

Метод создан в лаборатории молекулярной генетики Российского НИИ кардиологии и опубликован в 2003 г. Крындушкиным с соавт. [1] В оригинальном методе использовалась буферная система TAE и модифицированная система вакуумного блоттинга для переноса белков на мембрану (первоначально PVDF ). Модифицированная система вакуумного блоттинга на самом деле представляет собой капиллярный перенос с помощью вакуума, поскольку вакуум только помогает жидкости, которая уже прошла через гель и мембрану, покинуть систему.

Вариации

Также использовались другие модификации, например, описанные Багрианцевом и др. [7] с использованием традиционного влажного переноса и буферной системы TGB, а также другие, использующие полусухой перенос или капиллярный перенос. [8]

DD-AGE, дальнейшая вариация метода, в которой используются условия полной денатурации , включая восстанавливающие агенты, такие как дитиотреитол (DTT), и тепловую денатурацию при 95°C, подходит для анализа термостабильных телец включения полиглутаминовых белков . [9]

Рекомендации

  1. ^ аб Крындушкин Д.С.; Александров И.М.; Тер-Аванесян; Кушниров В.В. (2003). «Агрегаты прионов дрожжей [PSI+] образованы небольшими полимерами Sup35, фрагментированными Hsp104». Журнал биологической химии . 278 (49): 49636–43. дои : 10.1074/jbc.M307996200 . ПМИД  14507919.
  2. ^ Сальникова А.Б.; Крындушкин Д.С.; Смирнов В.Н.; Кушниров В.В.; Тер-Аванесян (2005). «Бессмысленное подавление дрожжевых клеток, сверхпродуцирующих Sup35 (eRF3), вызвано его ненаследственными амилоидами». Журнал биологической химии . 280 (10): 8808–12. дои : 10.1074/jbc.M410150200 . ПМИД  15618222.
  3. ^ Мериин AB; Чжан Х; Александров И.М.; Сальникова А.Б.; Тер-Аванесян MD; Чернов Ю.О.; Шерман М.Ю. (2007). «Машина эндоцитоза участвует в агрегации белков с расширенными полиглутаминовыми доменами». Журнал ФАСЭБ . 21 (8): 1915–25. дои : 10.1096/fj.06-6878com . PMID  17341688. S2CID  24922939.
  4. ^ Шкундина И.С.; Кушниров В.В.; Туите МФ; Тер-Аванесян (2006). «Роль N-концевых олигопептидных повторов дрожжевого прионного белка Sup35 в размножении и передаче прионных вариантов». Генетика . 172 (2): 827–35. doi : 10.1534/genetics.105.048660. ПМЦ 1456247 . ПМИД  16272413. 
  5. ^ Александров ИМ; Вишневская А.Б.; Тер-Аванесян; Кушниров В.В. (2008). «Появление и распространение амилоидов на основе полиглутамина в дрожжах: остатки тирозина способствуют фрагментации полимера». Журнал биологической химии . 283 (22): 15185–92. дои : 10.1074/jbc.M802071200 . ПМК 2397454 . ПМИД  18381282. 
  6. ^ Альберти С; Хафманн Р; Король О; Капила А; Линдквист С. (2009). «Систематическое исследование идентифицирует прионы и освещает особенности последовательности прионогенных белков». Клетка . 137 (1): 146–58. дои : 10.1016/j.cell.2009.02.044. ПМЦ 2683788 . ПМИД  19345193. 
  7. ^ Багрянцев С.Н.; Кушниров В.В.; Либман С.В. (2006). «Анализ амилоидных агрегатов с использованием электрофореза в агарозном геле». Амилоид, прионы и другие белковые агрегаты, часть Б. Методы энзимологии. Том. 412. стр. 33–48. дои : 10.1016/S0076-6879(06)12003-0. ISBN 9780121828172. ПМИД  17046650.
  8. ^ Хафманн Р; Линдквист С. (2008). «Скрининг агрегации амилоида с помощью электрофореза в полуденатурирующем моющем средстве и агарозном геле». Журнал визуализированных экспериментов (17). дои : 10.3791/838. ПМЦ 2723713 . ПМИД  19066511. 
  9. ^ Вебер Дж. Дж.; Голла М; Гуаитоли Дж; Ваничаван П; Хайер С.Н.; Хаузер С; Краль АС; Нагель М; Самер С; Ароника Э; Карлсон CR; Шёлс Л; Рисс О; Глекнер CJ; Нгуен Х.П.; Хюбенер-Шмид Дж (2017). «Комбинаторный подход к идентификации сайтов расщепления кальпаина в белке атаксине-3 при болезни Мачадо-Джозефа». Мозг . 140 (5): 1280–1299. дои : 10.1093/brain/awx039 . ПМИД  28334907.