.jpg/1280px-Brainbow_(Lichtman_2008).jpg)
Brainbow — это процесс, с помощью которого отдельные нейроны головного мозга можно отличить от соседних нейронов с помощью флуоресцентных белков. Путем случайного выражения различных соотношений красных, зеленых и синих производных зеленого флуоресцентного белка в отдельных нейронах можно пометить каждый нейрон отличительным цветом. Этот процесс внес большой вклад в область нейронной коннектомики .
Эта методика была первоначально разработана в 2007 году командой под руководством Джеффа В. Лихтмана и Джошуа Р. Сейнса из Гарвардского университета . [1] Оригинальный метод недавно был адаптирован для использования с другими модельными исследовательскими организмами, включая плодовую мушку ( Drosophila melanogaster ) , рыбку данио ( Danio rerio [2] ) и Arabidopsis thaliana . [3]
В то время как более ранние методы маркировки позволяли картировать лишь несколько нейронов, этот новый метод позволяет одновременно и дифференциально освещать более 100 нейронов с различными картами. Это приводит к его характерному разноцветному виду на изображениях, за что он получает свое имя и получает награды на конкурсах научной фотографии. [ нужна цитата ]
.jpg/1280px-Brainbow_(Smith_2007).jpg)
Первоначально Brainbow был разработан Джеффом В. Лихтманом и Джошуа Р. Сейнсом в Вашингтонском университете в Сент-Луисе . [1] Команда создала Brainbow, используя двухэтапный процесс: сначала была создана конкретная генетическая конструкция, которую можно было рекомбинировать в нескольких вариантах для получения одного из трех или четырех цветов на основе конкретных внедряемых флуоресцентных белков (XFP). [4] Затем несколько копий одной и той же трансгенной конструкции были вставлены в геном целевого вида, что привело к случайной экспрессии различных соотношений XFP и впоследствии привело к тому, что разные клетки начали проявлять различные красочные оттенки. [4]
Первоначально Brainbow был создан как усовершенствование более традиционных методов нейровизуализации , таких как окрашивание по Гольджи и введение красителя, которые представляли собой серьезные ограничения для исследователей в их способности визуализировать сложную архитектуру нейронных цепей в мозге . [1] В то время как более старые методы позволяли окрашивать клетки только в ограниченном диапазоне цветов, часто используя двух- и трехцветных трансгенных мышей для получения ограниченной информации о нейронных структурах, Brainbow гораздо более гибок, поскольку обладает способностью флуоресцентно маркировать отдельные нейроны примерно 100 различными оттенками, чтобы ученые могли идентифицировать и даже различать дендритные и аксональные процессы. [4] Раскрывая такую подробную информацию о связях и закономерностях нейронов, иногда даже in vivo, ученые часто могут сделать вывод о взаимодействии нейронов и их последующем влиянии на поведение и функции. Таким образом, Brainbow заполнил пустоту, оставленную предыдущими методами нейровизуализации.
С недавним появлением Brainbow в нейробиологии исследователи теперь могут создавать конкретные карты нейронных цепей и лучше исследовать, как они связаны с различной умственной деятельностью и связанным с ней поведением (т. е. Brainbow раскрывает информацию о взаимосвязях между нейронами и их последующих взаимодействиях, влияющих на общая функциональность мозга). Таким образом, в качестве дальнейшей экстраполяции этого метода Brainbow можно использовать для изучения как неврологических, так и психологических расстройств путем анализа различий в нейронных картах. [4]
Методы Brainbow основаны на рекомбинации Cre-Lox , при которой белок Cre-рекомбиназа вызывает инверсию или вырезание ДНК между сайтами loxP. Оригинальный метод Brainbow включает в себя как Brainbow-1, так и Brainbow-2, в которых используются разные формы рекомбинации cre/lox. Brainbow-3, модифицированная версия Brainbow-1, была разработана в 2013 году. [5] Для всех подтипов Brainbow выражение данного XFP является стохастическим или случайным событием.
Brainbow-1 использует конструкции ДНК с различными генами флуоресцентных белков (XFP), разделенными мутантной и канонической формами loxP. Это создает набор взаимоисключающих возможностей вырезания, поскольку cre-опосредованная рекомбинация происходит только между идентичными сайтами loxP. [1] После того, как происходит рекомбинация, флуоресцентный белок, остающийся непосредственно после промотора, экспрессируется уникальным образом. Таким образом, конструкция с четырьмя XFP, разделенными тремя разными сайтами loxP, тремя событиями вырезания и исходной конструкцией может продуцировать четыре разных флуоресцентных белка. [4]
Brainbow-2 использует вырезание и инверсию Cre, чтобы обеспечить несколько возможностей экспрессии в данной конструкции. В одном сегменте ДНК с двумя противоположно ориентированными XFP Cre вызывает случайное событие инверсии, которое оставляет один флуоресцентный белок в правильной ориентации для экспрессии. Если две из этих обратимых последовательностей выровнены, возможны три различных события инверсии. Если также учитывать события вырезания, один из четырех флуоресцентных белков будет экспрессироваться для данной комбинации вырезаний и инверсий Cre.
Brainbow-3 сохраняет формат loxP Brainbow-1, но заменяет гены RFP, YFP и CFP на mOrange2, EGFP и mKate2. mO2, EGFP и mK2 были выбраны как потому, что их спектры флуоресцентного возбуждения и испускания перекрываются минимально, так и потому, что они имеют минимальную гомологию последовательностей, что позволяет создавать селективные антитела, которые можно использовать для их обнаружения в иммуногистохимических протоколах. Brainbow-3 также решает проблему неравномерного заполнения нейронов XFP за счет использования фарнезилированных производных XFP, которые более равномерно доставляются к мембранам нейронов. [5]
Brainbow реализуется in vivo путем скрещивания двух штаммов трансгенных организмов: одного, который экспрессирует белок Cre, и другого, который был трансфицирован несколькими версиями конструкции loxP/XFP. Использование нескольких копий трансгена позволяет XFP объединяться таким образом, что можно получить один из примерно 100 различных цветов. [4] Таким образом, каждый нейрон помечен разным оттенком в зависимости от его комбинаторной и стохастической экспрессии флуоресцентных белков.
Чтобы объяснить дифференциальные закономерности экспрессии XFP в видимой форме, срезы мозга визуализируются с помощью конфокальной микроскопии . При воздействии фотона с определенной длиной волны возбуждения каждый флуорофор излучает сигнал, который собирается в красный, зеленый или синий канал, а полученная световая комбинация анализируется с помощью программного обеспечения для анализа данных. [1] Наложение нейронов разного цвета позволяет визуально распутать сложные нейронные цепи.
На сегодняшний день Brainbow преимущественно тестировался на мышах; однако описанная выше базовая методика также была модифицирована для использования в более поздних исследованиях с момента появления оригинального метода, представленного в 2007 году.
.jpg/1280px-Brainbow_(Ch%C3%A9dotal_and_Richards,_2010).jpg)
Мозг мыши имеет 75 000 000 нейронов и больше похож на человеческий мозг, чем на дрозофилу и другие организмы, обычно используемые для моделирования этого метода, такие как C. elegans . Мыши были первыми организмами, у которых был успешно применен метод нейровизуализации Brainbow. [1] Ливет и др. (2007) разработали две версии мышей Brainbow с использованием Brainbow-1 и Brainbow-2, которые описаны выше. [1] При использовании этих методов для создания полной карты и отслеживания аксонов мышцы мыши необходимо собрать десятки тысяч изображений и скомпилировать их в стопки для создания полной схемы. [4] Затем можно проследить каждый двигательный аксон и его синаптические контакты, чтобы построить полный коннектом мышцы.
Дополнительные примеры нейронов, исследованных с помощью метода Brainbow на трансгенных мышах, расположены в двигательном нерве, иннервирующем ушные мышцы, аксонных путях в стволе мозга и зубчатой извилине гиппокампа . [4]
Сложность мозга дрозофилы, состоящего примерно из 100 000 нейронов, делает его отличным кандидатом для реализации нейрофизиологических и нейробиологических методов, таких как Brainbow. Фактически, Стефани Хэмпель и др. (2011) объединили Brainbow с инструментами генетического нацеливания для идентификации отдельных нейронов в мозге дрозофилы и различных нейрональных линий. [6] Одним из инструментов генетического таргетинга была бинарная система экспрессии GAL4/UAS , которая контролирует экспрессию UAS-Brainbow и нацеливает ее на небольшие группы нейронов. Использование методов «Flip Out» увеличило клеточное разрешение репортерной конструкции. Экспрессия флуоресцентных белков, как и в случае с оригинальным Brainbow, зависела от рекомбинации Cre, соответствующей совпадающим сайтам lox. Хампель и др. (2011) также разработали свой собственный вариант Brainbow (dBrainbow), основанный на мечении эпитопов антителами, а не на эндогенной флуоресценции. [6] Две копии их конструкции дают шесть ярких, разделяемых цветов. Это, наряду с упрощением присвоения цветов, позволило им наблюдать траектории каждого нейрона на больших расстояниях. В частности, они проследили двигательные нейроны от доли усика до нервно-мышечных соединений, что позволило им идентифицировать конкретные мышечные мишени отдельных нейронов.
В конечном итоге этот метод дает возможность эффективно составить карту нейронных цепей у дрозофилы, чтобы исследователи могли получить больше информации о структуре мозга этого беспозвоночного и о том, как она связана с его последующим поведением.
Как и любой метод нейровизуализации , Brainbow имеет ряд ограничений, связанных с методами, необходимыми для его выполнения. Например, процесс выведения как минимум двух штаммов трансгенных животных из эмбриональных стволовых клеток является трудоемким и сложным. Даже если два трансгенных вида будут успешно созданы, не все их потомки проявят рекомбинацию. Таким образом, это требует тщательного планирования перед проведением эксперимента. [4]
Кроме того, из-за случайного характера экспрессии флуоресцентных белков ученые не могут точно контролировать маркировку нейронных цепей, что может привести к плохой идентификации конкретных нейронов.
Использование мозговой дуги в популяциях млекопитающих также затруднено невероятным разнообразием нейронов центральной нервной системы . Огромная плотность нейронов в сочетании с наличием длинных путей аксонов затрудняет просмотр больших областей ЦНС с высоким разрешением. Brainbow наиболее полезен при изучении разрешения отдельных клеток на фоне сложной многоклеточной среды. Однако из-за ограничений разрешения оптической микроскопии окончательную идентификацию синаптических связей между нейронами осуществить нелегко. Этой проблемы в некоторой степени можно избежать за счет использования синаптических маркеров в дополнение к использованию оптической микроскопии для просмотра синаптических связей. [7]
