Непрерывная эволюция с помощью фагов

Непрерывная эволюция с помощью фагов ( PACE ) — это основанная на фагах технология автоматизированной направленной эволюции белков. Она основана на связи желаемой активности целевого белка с пригодностью инфекционного бактериофага, который несет соответствующий ген белка. Белки с большей желаемой активностью, следовательно, придают большую инфекционность своему фагу-носителю. Более инфекционные фаги размножаются более эффективно, отбирая выгодные мутации. Генетическая вариация генерируется с использованием подверженных ошибкам полимераз на фаговых векторах , и со временем белок накапливает выгодные мутации. Эта технология примечательна тем, что выполняет сотни раундов отбора с минимальным вмешательством человека.

Принцип

Центральным компонентом PACE является сосуд фиксированного объема, известный как «лагуна». Лагуна содержит векторы бактериофага M13, несущие интересующий ген (известный как селективная плазмида, или SP), а также клетки-хозяева E. coli , которые позволяют фагу реплицироваться. Лагуна постоянно разбавляется путем добавления и слива жидкой среды, содержащей клетки E. coli . Скорость потока жидкости устанавливается таким образом, чтобы скорость разбавления была выше скорости размножения E. coli , но ниже скорости размножения фага. Таким образом, в лагуне постоянно присутствует свежий запас клеток E. coli , но фаг может быть сохранен только посредством достаточно быстрой репликации. ^[1]

Для репликации фага требуется инфекция E. coli , которая для фага M13 зависит от белка III (pIII). ^[2] При использовании PACE фаговые векторы не имеют гена для производства pIII. Вместо этого производство pIII связано с активностью интересующего белка через механизм, который варьируется в зависимости от варианта использования, часто вовлекая дополнительную плазмиду, содержащую ген III (gIII), экспрессирующий pIII, известный как вспомогательная плазмида, или AP. В частности, производство инфекционного фага масштабируется с производством pIII. ^[3] Следовательно, чем выше активность белка, тем выше скорость производства pIII и тем больше инфекционных фагов генерируется для этого конкретного гена.

Используя полимеразы, подверженные ошибкам (закодированные в плазмиде мутагенеза, или MP), генетическая вариация вводится в часть гена белка фаговых векторов. Из-за селективного давления, оказываемого постоянным осушением лагуны, только фаги, которые могут реплицироваться достаточно быстро, могут быть сохранены в лагуне, поэтому со временем полезные мутации накапливаются в фагах, реплицирующихся в лагуне. Таким образом, непрерывно выполняются циклы эволюции, что позволяет сотням циклов проходить с небольшим вмешательством человека. ^[1]

Общая схема PACE. MP обозначает плазмиду мутагенеза и кодирует необходимые белки для введения мутаций в SP. SP обозначает плазмиду селекции и кодирует ген бактериофага M13 без gIII, а также интересующий ген. AP обозначает плазмиду акцессорности и содержит gIII, а также метод индукции транскрипции gIII.

Приложения

Специфичность промотора полимеразы

В первоначальной статье, описывающей эту технику, РНК-полимеразы T7 были эволюционированы для распознавания различных промоутеров , таких как промоторы T3 или SP6. ^[4] Это было сделано путем превращения целевого промотора в единственный промотор для gIII. ^[5] Следовательно, мутантные полимеразы с большей специфичностью к желаемому промотору вызывали большую продукцию pIII. Это привело к полимеразам с активностью на ~3-4 порядка большей для целевого промотора, чем у исходного промотора T3. ^[4] В то время как эта исходная система PACE выполняла только положительный отбор, был разработан вариант, который допускал также и отрицательный отбор. Это делается путем связывания нежелательной активности с продукцией нефункционального pIII, что снижает количество произведенного инфекционного фага. ^[6]

Схема развития специфичности промотора полимеразы с использованием PACE. T7 RNAP, содержащая мутации, неблагоприятные для связывания промотора T3, приводит к отсутствию транскрипции gIII. Однако мутации, которые допускают связывание с промотором T3, приводят к увеличению транскрипции gIII.

Специфичность субстрата протеазы

Протеазы были разработаны для разрезания различных пептидов с использованием PACE. В этих системах желаемый сайт разрезания протеазы используется для связывания РНК-полимеразы T7 и лизоцима T7 . Лизоцим T7 предотвращает транскрипцию gIII полимеразой T7. Когда пептидный линкер расщепляется, полимераза T7 активируется, что позволяет транскрипцию гена pIII. Этот метод был использован для создания протеазы TEV с существенно отличающимся пептидным субстратом. ^{[6] [7]}

Схема использования PACE для развития активности протеазы. Когда T7 РНКП и T7 лизоцим связаны, транскрипция gIII блокируется. Когда протеаза активна для сайта расщепления, T7 полимераза высвобождается, позволяя транскрипцию gIII.

Ортогональные аминоацил-тРНК-синтетазы

Используя PACE, аминоацил-тРНК синтетазы (aaRSs) были также разработаны для неканонических аминокислот . Активность aaRS связана с продукцией pIII путем добавления стоп-кодона TAG в середину gIII. Синтетазы, которые аминоацилируют супрессорную тРНК кодона TAG, предотвращают активность стоп-кодона , позволяя производить функциональный pIII. Используя эту систему, были разработаны aaRSs, которые используют неканонические аминокислоты p -нитрофениланин, йодфенилаланин и Boc-лизин. ^[8]

Схема использования PACE для развития ортогональных аминоацил-тРНК-синтетаз. Без активности синтетазы T7 РНК-полимераза не может быть полностью транслирована из-за наличия стоп-кодона Amber. После введения функционирующей синтетазы для тРНК с кодоном Amber этот стоп-кодон Amber теперь кодирует неканоническую аминокислоту, что позволяет транскрипцию полной РНК-полимеразы T7 и, следовательно, позволяет транскрипцию gIII.

Взаимодействие белков между собой

Белково-белковые взаимодействия также развивались с использованием PACE. В этой схеме целевой белок сливается с ДНК-связывающим белком, который связывается с целевой последовательностью, расположенной выше промотора gIII. Белок, подвергающийся эволюции, сливается с РНК-полимеразой. Чем лучше белок-белковое взаимодействие, тем больше происходит транскрипции pIII, что позволяет развивать белок-белковое взаимодействие в условиях PACE. ^[6] Этот метод использовался для разработки вариантов эндотоксина Bacillus thuringiensis , которые могут преодолеть устойчивость к токсинам насекомых. ^{[6] [9]}

Схема использования PACE для развития белок-белковых взаимодействий. Целевой белок, фиолетовый, слит с ДНК-связывающим белком, синим. Развивающийся белок, красный, связан с функционирующей РНК-полимеразой, зеленой. При связывании ДНК-связывающего белка выше промотора gIII более благоприятное связывание между целевым и развивающимся белком приводит к более высокой транскрипции gIII.

Базовые редакторы

PACE использовался для эволюции APOBEC1 для лучшей растворимой экспрессии. APOBEC1 — это цитидиндезаминаза , которая нашла применение в редакторах оснований для катализа редактирования одного нуклеотида C-->T. ^[10] В E. coli APOBEC1 обычно выпадает из раствора в нерастворимую фракцию. ^[11] Для эволюции APOBEC1 для лучшей растворимой экспрессии N-конец полимеразы T7 был слит с APOBEC1, а оставшаяся часть полимеразы экспрессировалась отдельно. Полимераза T7 может функционировать только тогда, когда часть N-конца может связываться с остальной частью полимеразы. Поскольку APOBEC1 должен быть правильно свернут для того, чтобы часть N-конца была выставлена ​​должным образом, активность полимеразы T7 коррелирует со свертыванем APOBEC1. Как следует из этого, транскрипция и продукция pIII связаны с растворимой экспрессией APOBEC1 через полимеразу T7. Используя этот подход, растворимая экспрессия APOBEC1 увеличилась в 4 раза без изменения функции. ^{[7] [9]}

Схема для разработки более высокой растворимой экспрессии. POI = интересующий белок. Когда POI правильно сложен, часть T7n открыта, что позволяет связываться с частью T7c для образования полностью функциональной РНК-полимеразы T7. Эта РНК-полимераза T7 может затем транскрибировать gIII. Если POI неправильно сложен, то РНК-полимераза T7 не образуется, что приводит к отсутствию транскрипции gIII.

PACE также использовался для создания более каталитически активной дезоксиаденозиндезаминазы. Дезоксиаденозиндезаминаза используется в редакторах оснований для выполнения редактирования одного нуклеотида A-->T. Это было сделано путем помещения стоп-кодонов, содержащих аденозин, в ген полимеразы T7. Если редактор оснований способен исправить ошибку, производится функциональная полимераза T7, что позволяет производить pIII. Используя эту систему, они вывели дезоксиаденозиндезаминазу с 590-кратной активностью по сравнению с диким типом. ^[12]

Эволюция более активных дезоксиаденозиндезаминаз с использованием PACE. Здесь ген T7 РНКП содержит два стоп-кодона, оба из которых содержат аденозиновые нуклеотиды. Без активности дезоксиаденозиндезаминазы полученная T7 РНКП укорочена и, следовательно, нефункциональна. Однако при наличии функциональной дезоксиаденозиндезаминазы стоп-кодоны преобразуются в кодирующие аминокислоты кодоны, что позволяет производить функциональную T РНКП, которая может транскрибировать gIII.

Ссылки

1. Esvelt, K.; Carlson, J.; Liu, DR (2011). «Система для непрерывной направленной эволюции биомолекул». Nature . 472 (7344): 499–503. Bibcode :2011Natur.472..499E. doi :10.1038/nature09929. PMC  3084352 . PMID  21478873.
2. Рихманн, Л.; Холлигер, П. (1997). «C-концевой домен TolA является корецептором для заражения E. coli нитчатым фагом». Cell . 90 (2): 351–360. doi : 10.1016/s0092-8674(00)80342-6 . PMID  9244308.
3. Rakonjac, J.; Model, P. (1998). «Роли pIII в сборке нитчатых фагов». J. Mol. Biol . 282 (1): 25–41. doi :10.1006/jmbi.1998.2006. PMID  9733639.
4. Lane, MD; Seelig, B. (2014). «Достижения в направленной эволюции белков». Curr. Opin. Chem. Biol . 22 : 129–136. doi :10.1016/j.cbpa.2014.09.013. PMC 4253873 . PMID  25309990. 
5. Lemire, S.; Yehl, KM; Lu, TK (2018). «Применение фагов в синтетической биологии». Annu. Rev. Virol . 5 (1): 453–476. doi :10.1146/annurev-virology-092917-043544. PMC 6953747. PMID  30001182 . 
6. Brödel, AK; Isalan, M.; Jaramillo, A. (2018). «Инженерия биомолекул с помощью эволюции, направленной бактериофагами». Curr. Opin. Biotech . 51 : 32–38. doi : 10.1016/j.copbio.2017.11.004 . hdl : 10261/184372 . PMID  29175708.
7. Kim, JY; Yoo, HW; Lee, PG; Lee, SG; Seo, JH; Kim, BG (2019). " Эволюция белков in vivo , стратегия белковой инженерии следующего поколения: от случайного подхода к целевому подходу". Biotechnol. Bioproc. E. 24 : 85–94. doi :10.1007/s12257-018-0394-2. S2CID  91687131.
8. Варгас-Родригес, О.; Севостьянова, А.; Зёлль, Д.; Црнкович, А. (2018). «Модернизация аминоацил-тРНК-синтетаз для расширения генетического кода». Curr. Opin. Chem. Biol . 46C : 115–122. doi :10.1016/j.cbpa.2018.07.011. PMC 7083171 . PMID  30056281. 
9. Simon, AJ; d'Oelsnitz, S.; Ellington, AD (2018). «Синтетическая эволюция». Nat. Biotechnol . 37 (7): 730–743. doi :10.1038/s41587-019-0157-4. PMID  31209374. S2CID  189927244.
10. Gaudelli, NM; Komor, AC; Rees, HA; Packer, MS; Badran, AH; Bryson, DI; Liu, DR (2017). «Программируемое редактирование оснований A·T в G·C в геномной ДНК без расщепления ДНК». Nature . 551 (7681): 464–471. doi :10.1038/nature24644. PMC 5726555 . PMID  29160308. 
11. Ван, Т.; Бадран, AH; Хуан, TP; Лю, DR (2018). «Непрерывная направленная эволюция белков с улучшенной растворимой экспрессией». Nat. Chem. Biol . 14 (10): 972–980. doi :10.1038/s41589-018-0121-5. PMC 6143403. PMID  30127387 . 
12. Richter, MF; Zhao, KT; Eton, E.; Lapinaite, A.; Newby, GA; Thuronyi, BW; Wilson, C.; Koblan, LW; Zeng, J.; Bauer, DE; Doudna, JA; Liu, DR (2020). «Эволюция редактора адениновых оснований с помощью фага с улучшенной совместимостью и активностью домена Cas». Nat. Biotechnol . 38 (7): 883–891. doi :10.1038/s41587-020-0453-z. PMC 7357821. PMID  32433547 .