Нокауты генов (также известные как делеция генов или инактивация генов ) являются широко используемым методом генной инженерии, который включает в себя целенаправленное удаление или инактивацию определенного гена в геноме организма. Это может быть сделано с помощью различных методов, включая гомологичную рекомбинацию , CRISPR-Cas9 и TALENs .
Одним из главных преимуществ нокаутов генов является то, что они позволяют исследователям изучать функцию конкретного гена in vivo и понимать роль гена в нормальном развитии и физиологии, а также в патологии заболеваний. Изучая фенотип организма с нокаутированным геном, исследователи могут получить представление о биологических процессах, в которых участвует ген.
Существует два основных типа нокаутов генов: полный и условный. Полный нокаут гена навсегда инактивирует ген, в то время как условный нокаут гена позволяет гену выключаться и включаться в определенное время или в определенных тканях. Условные нокауты особенно полезны для изучения процессов развития и для понимания роли гена в определенных типах клеток или тканях.
Нокауты генов широко использовались во многих различных организмах, включая бактерии, дрожжи, плодовых мушек, данио-рерио и мышей. У мышей нокауты генов обычно используются для изучения функции определенных генов в развитии, физиологии и исследованиях рака.
Использование нокаутов генов в мышиных моделях оказалось особенно ценным в изучении заболеваний человека. Например, нокауты генов в мышах использовались для изучения роли определенных генов в развитии рака, неврологических расстройств, иммунных расстройств и метаболических расстройств.
Однако нокауты генов также имеют некоторые ограничения. Например, потеря одного гена может не полностью имитировать эффекты генетического расстройства, а нокауты могут иметь непреднамеренные эффекты на другие гены или пути. Кроме того, нокауты генов не всегда являются хорошей моделью для человеческих заболеваний, поскольку геном мыши не идентичен геному человека, а физиология мыши отличается от физиологии человека.
Техника KO по сути является противоположностью нокаута гена . Нокаутирование двух генов одновременно в организме известно как двойной нокаут ( DKO ). Аналогично термины тройной нокаут ( TKO ) и четверной нокаут ( QKO ) используются для описания трех или четырех нокаутированных генов соответственно. Однако необходимо различать гетерозиготные и гомозиготные KO. В первом случае нокаутируется только одна из двух копий гена ( аллелей ), во втором — обе.
Нокауты достигаются с помощью различных методов. Первоначально были идентифицированы естественные мутации , а затем потеря гена или инактивация должны были быть установлены с помощью секвенирования ДНК или других методов. [1]
Нокаут гена мутацией обычно проводится в бактериях. Ранний пример использования этой техники в Escherichia coli был опубликован в 1989 году Гамильтоном и др. [2] В этом эксперименте для удаления гена использовались две последовательные рекомбинации. Эта работа установила осуществимость удаления или замены функционального гена в бактериях. С тех пор этот метод был разработан для других организмов, в частности, для исследовательских животных, таких как мыши. Нокаутированных мышей обычно используют для изучения генов с человеческими эквивалентами, которые могут иметь значение для заболевания. Примером исследования с использованием нокаутированных мышей является исследование ролей белков Xirp в синдроме внезапной необъяснимой ночной смерти (SUNDS) и синдроме Бругада в китайской популяции хань. [3]
Для исследований генного нокаута популярность приобрел более современный метод РНК-интерференции (РНКi), также известный как подавление генов. При РНК-интерференции (РНКi) информационная РНК для определенного гена инактивируется с помощью малой интерферирующей РНК (siRNA) или короткой шпилечной РНК (shRNA). Это эффективно останавливает экспрессию гена. Онкогены, такие как Bcl-2 и p53, а также гены, связанные с неврологическими заболеваниями, генетическими расстройствами и вирусными инфекциями, были выбраны для подавления генов с помощью РНК-интерференции (РНКi). [ необходима цитата ]
Гомологичная рекомбинация — это обмен генами между двумя цепями ДНК, которые включают обширные области последовательностей оснований, которые идентичны друг другу. У эукариотических видов, бактерий и некоторых вирусов гомологичная рекомбинация происходит спонтанно и является полезным инструментом в генной инженерии. Гомологичная рекомбинация, которая происходит во время мейоза у эукариот, необходима для восстановления двухцепочечных разрывов ДНК и способствует генетической изменчивости, позволяя перемещать генетическую информацию во время хромосомного скрещивания. Гомологичная рекомбинация, ключевой механизм восстановления ДНК у бактерий, позволяет вставлять генетический материал, приобретенный посредством горизонтального переноса генов и трансформации в ДНК. Гомологичная рекомбинация у вирусов влияет на ход вирусной эволюции. Гомологичная рекомбинация, тип нацеливания генов, используемый в генной инженерии, включает в себя введение сконструированной мутации в определенный ген, чтобы узнать больше о функции этого гена. Этот метод включает вставку чужеродной ДНК в клетку, которая имеет последовательность, похожую на целевой ген, и при этом окружена последовательностями, которые являются такими же выше и ниже целевого гена. ДНК целевого гена заменяется чужеродной последовательностью ДНК во время репликации, когда клетка обнаруживает похожие фланкирующие области как гомологи. Целевой ген «выключается» путем обмена. Используя эту технику для нацеливания на определенные аллели в эмбриональных стволовых клетках у мышей, можно создать нокаутных мышей. С помощью нацеливания на гены были отключены многочисленные мышиные гены, что привело к созданию сотен различных мышиных моделей различных заболеваний человека, таких как рак, диабет, сердечно-сосудистые заболевания и неврологические расстройства. [ необходима цитата ] Марио Капеччи, сэр Мартин Дж. Эванс и Оливер Смитис провели новаторское исследование гомологичной рекомбинации в мышиных стволовых клетках, и они разделили Нобелевскую премию по физиологии и медицине 2007 года за свои открытия. [4] Традиционно гомологичная рекомбинация была основным методом, вызывающим нокаут гена. Этот метод включает создание конструкции ДНК , содержащей желаемую мутацию. Для целей нокаута это обычно включает маркер устойчивости к лекарственным препаратам вместо желаемого нокаутирующего гена. [5] Конструкция также будет содержать минимум 2 кб гомологии с целевой последовательностью. Конструкция может быть доставлена в стволовые клетки либо посредством микроинъекции , либо посредством электропорации . Затем этот метод полагается на собственные механизмы восстановления клетки для рекомбинации конструкции ДНК в существующую ДНК. Это приводит к изменению последовательности гена, и в большинстве случаев ген будет транслироватьсяв нефункциональный белок , если он вообще транслируется. Однако это неэффективный процесс, поскольку гомологичная рекомбинация составляет всего от 10−2 до 10−3 интеграций ДНК. [5] [6] Часто маркер селекции препарата на конструкции используется для отбора клеток, в которых произошло событие рекомбинации.
Эти стволовые клетки, в которых сейчас отсутствует ген, можно использовать in vivo , например, у мышей, вставляя их в ранние эмбрионы. Если полученная химерная мышь содержала генетическое изменение в своей зародышевой линии, это можно было бы передать потомству. [5]
В диплоидных организмах, которые содержат два аллеля для большинства генов, а также могут содержать несколько родственных генов, которые сотрудничают в одной и той же роли, дополнительные раунды трансформации и отбора выполняются до тех пор, пока каждый целевой ген не будет выбит. Для получения гомозиготных нокаутированных животных может потребоваться селективное разведение .
.jpg/1280px-Frameshift_mutations_(13080927393).jpg)
В настоящее время используются три метода, которые включают точное нацеливание на последовательность ДНК для введения двухцепочечного разрыва. Как только это происходит, механизмы восстановления клетки пытаются восстановить этот двухцепочечный разрыв, часто посредством негомологичного соединения концов (NHEJ), которое включает прямое лигирование двух разрезанных концов вместе. [6] Это может быть сделано несовершенно, поэтому иногда вызывает вставки или делеции пар оснований, которые вызывают мутации со сдвигом рамки считывания . Эти мутации могут сделать ген, в котором они происходят, нефункциональным, тем самым вызывая нокаут этого гена. Этот процесс более эффективен, чем гомологичная рекомбинация, и поэтому его легче использовать для создания биаллельных нокаутов. [6]
Нуклеазы с цинковыми пальцами состоят из доменов связывания ДНК, которые могут точно нацеливаться на последовательность ДНК. [6] Каждый цинковый палец может распознавать кодоны желаемой последовательности ДНК, и, следовательно, может быть модульно собран для связывания с определенной последовательностью. [8] Эти связывающие домены связаны с эндонуклеазой рестрикции , которая может вызывать двухцепочечный разрыв (DSB) в ДНК. [6] Процессы восстановления могут вносить мутации, которые разрушают функциональность гена. [ необходима ссылка ]
Эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции ( TALEN ), также содержат домен связывания ДНК и нуклеазу, которая может расщеплять ДНК. [9] Область связывания ДНК состоит из повторов аминокислот, каждый из которых распознает одну пару оснований желаемой целевой последовательности ДНК. [8] Если это расщепление нацелено на кодирующую область гена, а опосредованная NHEJ репарация вносит вставки и делеции, часто возникает мутация со сдвигом рамки считывания, тем самым нарушая функцию гена. [9]
CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) — это метод генной инженерии, позволяющий точно редактировать геном. Одним из применений CRISPR является нокаутирование генов, которое подразумевает отключение или «выключение» определенного гена в организме. [ необходима цитата ]
Процесс нокаута гена с помощью CRISPR включает три основных этапа: проектирование направляющей РНК (гРНК), которая нацелена на определенное место в геноме, доставка гРНК и фермента Cas9 (действующего как молекулярные ножницы) в целевую клетку, а затем предоставление клетке возможности восстановить разрез в ДНК. Когда клетка восстанавливает разрез, она может либо соединить концы разреза вместе, что приведет к нефункциональному гену, либо ввести мутацию, которая нарушает функцию гена.
Эту технику можно использовать в различных организмах, включая бактерии, дрожжи, растения и животных, и она позволяет ученым изучать функцию определенных генов, наблюдая за эффектами их отсутствия. Нокаут генов на основе CRISPR является мощным инструментом для понимания генетической основы заболеваний и разработки новых методов лечения.
Важно отметить, что нокаут гена на основе CRISPR, как и любой метод генной инженерии, может иметь потенциал для непреднамеренного или вредного воздействия на организм, поэтому его следует использовать с осторожностью. [8] [10] Связанный Cas9 вызовет двухцепочечный разрыв в ДНК. [8] Следуя тому же принципу, что и цинковые пальцы и TALEN, попытки восстановить эти двухцепочечные разрывы часто приводят к мутациям со сдвигом рамки считывания, которые приводят к нефункциональному гену. [8] Неинвазивная технология CRISPR-Cas9 успешно нокаутировала ген, связанный с депрессией и тревожностью у мышей, что стало первой успешной доставкой, проходящей через гематоэнцефалический барьер, что позволило модифицировать ген. [11]
Вставка гена похожа на выбивку гена, но при этом ген заменяется другим, а не удаляется. [ необходима цитата ]
Условный нокаут гена позволяет удалять ген в ткани тканеспецифичным образом. Это требуется вместо нокаута гена, если нулевая мутация приведет к эмбриональной смерти [12] или конкретная ткань или тип клеток представляют особый интерес. Это делается путем введения коротких последовательностей, называемых сайтами loxP, вокруг гена. Эти последовательности будут введены в зародышевую линию с помощью того же механизма, что и нокаут. Затем эту зародышевую линию можно скрестить с другой зародышевой линией, содержащей Cre-рекомбиназу , которая является вирусным ферментом, который может распознавать эти последовательности, рекомбинировать их и удалять ген, фланкированный этими сайтами. [ необходима цитата ]
Гены, не участвующие в раннем развитии, были эффективно изучены с помощью подходов нокаута, которые используют делецию генов. Однако, как правило, невозможно вырубить гены, которые активны на раннем развитии, без того, чтобы организм не потерпел фатальный исход. Одним из методов, позволяющих это сделать, является условный нокаут. Используя сайт-специфическую рекомбиназу, называемую Cre, исходная техника условного нокаута рекомбинировала короткие целевые последовательности, известные как LoxP. С тех пор были созданы и использованы в экспериментах по условному нокауту другие рекомбиназы. [ необходима цитата ]
Нокауты в основном используются для понимания роли конкретного гена или участка ДНК путем сравнения нокаутированного организма с диким типом со схожим генетическим фоном. [ необходима ссылка ]
Нокаутные организмы также используются в качестве инструментов скрининга при разработке лекарств , для выявления конкретных биологических процессов или недостатков с помощью конкретного нокаута или для понимания механизма действия препарата с помощью библиотеки нокаутных организмов, охватывающих весь геном , например, в Saccharomyces cerevisiae . [13]