Нокаут генов (также известный как удаление гена или инактивация гена ) — это широко используемый метод генной инженерии, который включает в себя целенаправленное удаление или инактивацию определенного гена в геноме организма. Это можно сделать с помощью различных методов, включая гомологичную рекомбинацию , CRISPR-Cas9 и TALEN .
Одним из основных преимуществ нокаутов генов является то, что они позволяют исследователям изучать функцию конкретного гена in vivo и понимать роль гена в нормальном развитии и физиологии, а также в патологии заболеваний. Изучая фенотип организма с нокаутным геном, исследователи могут получить представление о биологических процессах, в которых участвует этот ген.
Существует два основных типа нокаута генов: полный и условный. Полный нокаут гена навсегда инактивирует ген, тогда как условный нокаут гена позволяет включать и выключать ген в определенное время или в определенных тканях. Условные нокауты особенно полезны для изучения процессов развития и для понимания роли гена в определенных типах клеток или тканях.
Нокауты генов широко используются во многих различных организмах, включая бактерии, дрожжи, плодовых мух, рыбок данио и мышей. У мышей нокаут генов обычно используется для изучения функции определенных генов в развитии, физиологии и исследованиях рака.
Использование нокаутов генов на моделях мышей оказалось особенно ценным при изучении заболеваний человека. Например, нокаут генов у мышей использовался для изучения роли конкретных генов в развитии рака, неврологических расстройств, иммунных нарушений и нарушений обмена веществ.
Однако нокаут генов также имеет некоторые ограничения. Например, потеря одного гена может не полностью имитировать последствия генетического заболевания, а нокауты могут иметь непреднамеренные последствия для других генов или путей. Кроме того, нокауты генов не всегда являются хорошей моделью заболеваний человека, поскольку геном мыши не идентичен геному человека, а физиология мыши отличается от физиологии человека.
Техника нокаута по сути является противоположностью нокаута гена . Нокаут двух генов одновременно в организме известен как двойной нокаут ( ДКО ). Аналогичным образом, термины тройной нокаут ( TKO ) и четверной нокаут ( QKO ) используются для описания трех или четырех нокаутных генов соответственно. Однако необходимо различать гетерозиготные и гомозиготные КО. В первом случае нокаутируется только одна из двух копий гена ( аллелей ), во втором — обе.
Нокауты осуществляются с помощью различных техник. Первоначально были идентифицированы естественные мутации , а затем необходимо было установить потерю или инактивацию генов с помощью секвенирования ДНК или других методов. [1]
Нокаут гена путем мутации обычно осуществляется у бактерий. Первый пример использования этого метода на Escherichia coli был опубликован в 1989 году Гамильтоном и др. [2] В этом эксперименте для удаления гена использовались две последовательные рекомбинации. Эта работа установила возможность удаления или замены функционального гена у бактерий. С тех пор этот метод был разработан для других организмов, особенно для экспериментальных животных, таких как мыши. Нокаутных мышей обычно используют для изучения генов, эквивалентных человеческим, которые могут иметь значение для заболеваний. Примером исследования с использованием нокаутных мышей является изучение роли белков Xirp в синдроме внезапной необъяснимой ночной смерти (SUNDS) и синдроме Бругада в китайской популяции хань. [3]
Для исследований нокаута генов приобрел популярность РНК-интерференция (РНКи), более новый метод, также известный как подавление генов. При РНК-интерференции (РНКи) информационная РНК для определенного гена инактивируется с помощью малой интерферирующей РНК (миРНК) или короткой шпилечной РНК (кшРНК). Это эффективно останавливает экспрессию гена. Онкогены, такие как Bcl-2 и p53, а также гены, связанные с неврологическими заболеваниями, генетическими нарушениями и вирусными инфекциями, были нацелены на подавление генов с использованием РНК-интерференции (RNAi). [ нужна цитата ]
Гомологичная рекомбинация — это обмен генами между двумя цепями ДНК, которые включают обширные области последовательностей оснований, идентичных друг другу. У эукариотических видов, бактерий и некоторых вирусов гомологичная рекомбинация происходит спонтанно и является полезным инструментом генной инженерии. Гомологичная рекомбинация, которая происходит во время мейоза у эукариот, необходима для восстановления двухцепочечных разрывов ДНК и способствует генетической изменчивости, обеспечивая перемещение генетической информации во время хромосомного скрещивания. Гомологичная рекомбинация, ключевой механизм репарации ДНК у бактерий, позволяет вставлять генетический материал, полученный в результате горизонтального переноса генов и трансформации в ДНК. Гомологичная рекомбинация в вирусах влияет на ход вирусной эволюции. Гомологичная рекомбинация, тип генной направленности, используемый в генной инженерии, включает в себя введение искусственной мутации в конкретный ген, чтобы узнать больше о функции этого гена. Этот метод включает в себя вставку чужеродной ДНК в клетку, которая имеет последовательность, аналогичную целевому гену, и в то же время фланкирована последовательностями, одинаковыми выше и ниже целевого гена. ДНК целевого гена заменяется чужеродной последовательностью ДНК во время репликации, когда клетка обнаруживает аналогичные фланкирующие области как гомологи. Целевой ген «выбивается» в результате обмена. Используя этот метод для воздействия на определенные аллели в эмбриональных стволовых клетках мышей, можно создать нокаутных мышей. С помощью генного таргетинга были отключены многочисленные мышиные гены, что привело к созданию сотен различных мышиных моделей различных заболеваний человека, таких как рак, диабет, сердечно-сосудистые заболевания и неврологические расстройства. [ нужна цитация ] Марио Капечки, сэр Мартин Дж. Эванс и Оливер Смитис провели новаторские исследования гомологичной рекомбинации в стволовых клетках мыши и разделили Нобелевскую премию 2007 года по физиологии и медицине за свои открытия. [4] Традиционно гомологичная рекомбинация была основным методом вызывания нокаута гена. Этот метод предполагает создание конструкции ДНК , содержащей желаемую мутацию. Для целей нокаута обычно вместо желаемого нокаутного гена используется маркер лекарственной устойчивости. [5] Конструкция также будет содержать минимум 2 т.п. гомологичности с целевой последовательностью. Конструкция может быть доставлена в стволовые клетки посредством микроинъекции или электропорации . Затем этот метод опирается на собственные механизмы восстановления клетки для рекомбинации конструкции ДНК в существующую ДНК. Это приводит к изменению последовательности гена, и в большинстве случаев ген будет транслироваться.в нефункциональный белок , если он вообще транслируется. Однако это неэффективный процесс, поскольку на гомологичную рекомбинацию приходится только от 10 -2 до 10 -3 интеграций ДНК. [5] [6] Часто маркер селекции лекарственного средства на конструкции используется для отбора клеток, в которых произошло событие рекомбинации.
Эти стволовые клетки, в которых сейчас отсутствует ген, можно было бы использовать in vivo , например, у мышей, вставив их в ранние эмбрионы. Если бы полученная химерная мышь содержала генетическое изменение в зародышевой линии, его можно было бы затем передать потомству. [5]
В диплоидных организмах, которые содержат две аллели для большинства генов, а также могут содержать несколько родственных генов, выполняющих одну и ту же роль, выполняются дополнительные раунды трансформации и отбора, пока каждый целевой ген не будет нокаутирован. Для получения гомозиготных нокаутных животных может потребоваться селективное разведение .
.jpg/1280px-Frameshift_mutations_(13080927393).jpg)
В настоящее время используются три метода, которые включают точное воздействие на последовательность ДНК для создания двухцепочечного разрыва. Как только это произойдет, механизмы восстановления клетки попытаются восстановить этот двухцепочечный разрыв, часто посредством негомологичного соединения концов (NHEJ), которое включает прямое лигирование двух разрезанных концов вместе. [6] Это может быть сделано несовершенно, что иногда приводит к вставкам или делециям пар оснований, которые вызывают мутации сдвига рамки считывания . Эти мутации могут сделать ген, в котором они происходят, нефункциональным, тем самым вызывая нокаут этого гена. Этот процесс более эффективен, чем гомологичная рекомбинация, и поэтому его легче использовать для создания биаллельных нокаутов. [6]
Нуклеазы с цинковыми пальцами состоят из ДНК-связывающих доменов, которые могут точно нацеливаться на последовательность ДНК. [6] Каждый цинковый палец может распознавать кодоны желаемой последовательности ДНК и, следовательно, может быть модульно собран для связывания с определенной последовательностью. [8] Эти связывающие домены связаны с эндонуклеазой рестрикции , которая может вызывать двухцепочечный разрыв (DSB) в ДНК. [6] Процессы восстановления могут привести к мутациям, которые нарушают функциональность гена. [ нужна цитата ]
Эффекторные нуклеазы, подобные активатору транскрипции ( TALEN ), также содержат ДНК-связывающий домен и нуклеазу, которая может расщеплять ДНК. [9] Область связывания ДНК состоит из повторов аминокислот, каждый из которых распознает одну пару оснований желаемой целевой последовательности ДНК. [8] Если это расщепление нацелено на область, кодирующую ген, и NHEJ-опосредованная репарация приводит к вставкам и делециям, часто возникает мутация сдвига рамки считывания, что нарушает функцию гена. [9]
CRISPR (Кластеризованные регулярные короткие палиндромные повторы) — это метод генной инженерии, позволяющий точно редактировать геном. Одним из применений CRISPR является нокаут гена, который включает в себя отключение или «выключение» определенного гена в организме. [ нужна цитата ]
Процесс нокаута гена с помощью CRISPR включает три основных этапа: создание направляющей РНК (гРНК), которая нацелена на определенное место в геноме, доставку гРНК и фермента Cas9 (который действует как молекулярные ножницы) в клетку-мишень, а затем позволяя клетке восстановить разрез ДНК. Когда клетка восстанавливает разрез, она может либо соединить концы разреза вместе, что приведет к нефункциональному гену, либо внести мутацию, которая нарушает функцию гена.
Этот метод можно использовать на различных организмах, включая бактерии, дрожжи, растения и животных, и он позволяет ученым изучать функцию определенных генов, наблюдая за последствиями их отсутствия. Нокаут генов на основе CRISPR — мощный инструмент для понимания генетической основы заболеваний и разработки новых методов лечения.
Важно отметить, что нокаут генов с помощью CRISPR, как и любой метод генной инженерии, может оказать непреднамеренное или вредное воздействие на организм, поэтому его следует использовать с осторожностью. [8] [10] Соединение Cas9 вызывает двухцепочечный разрыв ДНК. [8] Следуя тому же принципу, что и цинковые пальцы и TALEN, попытки восстановить эти двухцепочечные разрывы часто приводят к мутациям сдвига рамки считывания, которые приводят к нефункциональному гену. [8] Неинвазивная технология CRISPR-Cas9 успешно уничтожила ген, связанный с депрессией и тревогой у мышей, став первой успешной доставкой, проходящей через гематоэнцефалический барьер и позволяющей модифицировать ген. [11]
Нокаут гена аналогичен нокауту гена, но он заменяет ген другим, а не удаляет его. [ нужна цитата ]
Условный нокаут гена позволяет удалить ген в ткани тканеспецифичным способом. Это требуется вместо нокаута гена, если нулевая мутация может привести к гибели эмбриона [12] или конкретный тип ткани или клеток представляет особый интерес. Это делается путем введения вокруг гена коротких последовательностей, называемых сайтами loxP. Эти последовательности будут введены в зародышевую линию с помощью того же механизма, что и нокаут. Эту зародышевую линию затем можно скрестить с другой зародышевой линией, содержащей Cre-рекомбиназу , которая представляет собой вирусный фермент, который может распознавать эти последовательности, рекомбинировать их и удалять ген, фланкированный этими сайтами. [ нужна цитата ]
Гены, не участвующие в раннем развитии, были эффективно изучены с использованием нокаутных подходов, в которых используется делеция генов. Однако обычно невозможно уничтожить гены, активные на ранних стадиях развития, без смертельного исхода для организма. Одним из способов решения этой проблемы является условный нокаут. Используя сайт-специфическую рекомбиназу Cre, оригинальный метод условного нокаута рекомбинировал короткие целевые последовательности, известные как LoxP. С тех пор были созданы и использованы в экспериментах по условному нокауту другие рекомбиназы. [ нужна цитата ]
Нокауты в основном используются для понимания роли определенного гена или участка ДНК путем сравнения нокаутного организма с диким типом с аналогичным генетическим фоном. [ нужна цитата ]
Нокаутные организмы также используются в качестве инструментов скрининга при разработке лекарств , для выявления конкретных биологических процессов или недостатков с помощью специфического нокаута или для понимания механизма действия лекарства с помощью библиотеки нокаутных организмов , охватывающей весь геном , например как у Saccharomyces cerevisiae . [13]